Name: experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts at JoVE.com

Vi tackar Dr Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) för generösa stöd och handledning av detta arbete och Mr Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester) för kritiska redigering av detta manuskript. Detta projekt stöds av forskning Storbritannien (CR-Storbritannien) licensnummer C147/A6058 (AO)

1. Isolering av primära odlade humana normala bröst fibroblaster Experimentella förfaranden för att isolera primär odlade humana normala bröst fibroblaster beskrivs i figur. 1A. <ol><li> Förbered cellen dissociation buffert, som beskrivits tidigare 12: Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) med 10% fetalt kalv serum (FCS), penicillin-streptomycin (200 enheter / ml), kollagenas typ I (1 mg / ml) och hyaluronidas ( 125 enheter / ml). </li><li> Tvätta bröstvävnad skäras ...

<ol>
	<li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+by+proxy:+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence?.">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?.</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+and+SF/HGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac.">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment.">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li><li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li><li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li></ol>

Bristen på CAF-specifika markörer och graden av heterogenitet som observerats bland CAFS göra karakterisering av denna celltyp en utmaning i sig. Studera CAFS in vitro har även hindrats av den ytterligare komplikation att dessa celler senesce och stoppa sprider sig vid odling under lång tid. Våra tidigare försök att direkt föreviga primära CAFS använder ett retrovirus hTERT cDNA konstruera misslyckades. Därför att ytterligare undersöka tumören främja egenskaperna hos dessa celler har vi utveckla...

<table border="1"><tr><td> Materialnamn </td><td> Typ </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Fostrets kalvserum </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10.270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenas typ I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> hyaluronidas </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin (V9) antikropp </td><td></td><td> Novocastra Laboratories </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascin C (BC-8) antikropp </td><td></td><td></td><td></td><td> en gåva från Dr <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) antikropp </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolyl-4-hydroxylas </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) antikropp </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kollagen typ 1 1A antikropp </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-Cytokeratin antikropp </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin antikropp </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610.077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblastliknande specifikt protein-1) antikropp </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblast ytprotein (Klon 1B10) antikropp </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP konstruera </td><td></td><td></td><td></td><td> Begäran till författarna </td></tr><tr><td> pBabe-Puro konstruera </td><td></td><td></td><td></td><td> Köp från Addgene </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml koniska rör </td><td></td><td> Corning </td><td> 430.766 </td><td></td></tr><tr><td> Nude mus </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Kvinna NCR naken </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 celler </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Carcinom är komplexa vävnader består av neoplastiska celler och en icke-cancerogena fack kallad &quot;stroma. Den glatta består av extracellulärt matrix (ECM) och en mängd mesenkymala celler, bland andra fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller, pericyter och leukocyter 1-3. Den tumörförknippade stroma är lyhörd för omfattande parakrina signaler släpptes av angränsande cancer celler. Under sjukdomsprocessen, ofta stroma blir befolkad av cancer-associerade fibroblaster (CAFS) inklusive ett stort antal myofibroblaster. Dessa celler har tidigare hämtats från många olika typer av mänskligt karcinom för in vitro-kultur. En subpopulation av CAFS kan särskiljas genom deras uppreglering av α-glatt muskulatur aktin (α-SMA) uttryck 4,5. Dessa celler är ett kännetecken för &quot;aktiverade fibroblaster&quot; som har liknande egenskaper med myofibroblaster Commonly observerats i skadade och fibrotiska vävnader 6. Förekomsten av denna myofibroblastic CAF delmängd är starkt relaterad till höggradig maligniteter och förenat med dålig prognos hos patienter. Många laboratorier, inklusive vår egen, har visat att CAFS när injiceras med cancer celler till nedsatt immunförsvar möss, kan avsevärt främja tumourigenesis 7-10. CAFS beretts av cancer patienter kan dock ofta genomgå åldrande vid utbredning i kulturen begränsar i omfattningen av deras användning inom pågående experiment. För att övervinna denna svårighet har vi utvecklat en ny teknik att experimentellt generera förevigade mänskliga bröst CAF cellinjer (exp-CAFS) från människans bröst fibroblaster, med hjälp av en coimplantation bröst modell tumören xenograft. För att generera exp-CAFS, överordnad mänskliga bröst fibroblaster, framställda av minskningen mammoplasty vävnaden, var först immortalised med hTERT, den katalytiska subenheten av telomeras holoenzyme, och konstruerade för att uttrycka GFP och en puromycin motstånd gen. Dessa celler coimplanted med MCF-7 mänskliga celler bröstcancer som uttrycker en aktiverad Ras onkogen (MCF-7-ras celler) till en mus xenograft. Efter en tid av inkubation in vivo var initialt injicerade mänskliga bröst fibroblaster ur tumörxenografter på grundval av deras puromycin motstånd 11. Vi konstaterade att den bofasta människans bröst fibroblaster har differentierat, att anta ett myofibroblastic fenotyp och förvärvad tumör-främjande egenskaper under tumörprogression. Viktigt är dessa celler, som definieras som exp-CAFS, nära efterliknar tumör-främjande myofibroblastic fenotyp CAFS isolerade från bröst carcinom dissekeras från patienter. Vår tumör xenograft-derived exp-CAFS ger därför en effektiv modell för att studera biologi CAFS i mänskliga Breast karcinom. Den beskrivna protokollet kan också utvidgas för att skapa och karakterisera olika CAF befolkningen härstammar från andra typer av mänskligt karcinom.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts at JoVE.com

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Cancer-associerade fibroblaster (CAFS) med rik myofibroblaster vistas i tumören glatta spela en viktig roll i att driva tumörtillväxt. Vi utvecklade en coimplantation modell tumör xengraft för experimentellt generera CAFS från mänsklig bröst fibroblaster. Protokollet beskriver hur man kan upprätta CAF myofibroblaster att förvärva en förmåga att främja tumourigenesis.

Experimentell generationens Cancer Associated-fibroblasts (CAFS) från Human bröst fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcellstransplantation i en In vitro Simulerad ischemi / Reperfusion Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Human inre bröstartären (IMA) Transplantation och stentning: A Human modell för att studera utvecklingen av in-stent restenos

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Skin stansbiopsi Explantationsersättning Kultur för Derivering av primära humana fibroblaster

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Användning av primära humana fibroblaster för övervakning Mitokondriella fenotyper inom området för Parkinsons sjukdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimentell Human Pneumococcal Transport

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molekylär profilering av Invasive tumormicroenvironmenten i en 3-dimensionell modell av kolorektal cancer celler och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblaster

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell för att studera Hormone Action i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Utvärdering av lungmetastas i musbrösttumör Modeller av kvantitativ realtids-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Characterization efter en ny Disaggregation metod för Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...