Name: isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay at JoVE.com

लेखकों के लिए मिसौरी शैक्षणिक सहायता केंद्र है जो इस वीडियो का उत्पादन के विश्वविद्यालय में रचनात्मक सेवाओं टीम का शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. यह काम Eunice कैनेडी बाल स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के स्वास्थ्य एवं मानव विकास की श्राइवर नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ मैनेजमैंट, अनुदान HD055231 संख्या द्वारा समर्थित किया गया

1. माउस नाल के विच्छेदन <ol><li> चूहों के संभोग जोड़े सेट. </li><li> बाद के दिनों में से प्रत्येक पर, एक मैथुनविषयक प्लग की उपस्थिति के लिए जाँच करें. जो दिन में एक प्लग का पता चला है 0.5 (डीपीसी) के बाद सहवास 7 ?...

<ol>
	<li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion.">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li><li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta:+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening.">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li><li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts.">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li><li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion.">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

इस वीडियो में, हम माउस नाल से ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के अलगाव को प्रदर्शित करता है. हम तो ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण के लिए एक में इन विट्रो परख दिखाते हैं. इस प्रक्रिया का उपयोग कर, एक बड़े पैमाने पर है, लेकि?...

Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
<table border='1'>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>50ml</td>
 <td>1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>2.383 g</td>
 <td>0.02M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sodium bicarbonate</td>
 <td>0.42 g</td>
 <td>0.01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicllin-Streptomycin</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>100 U- 100 &mu;g /ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile dH20</td>
 <td>to 500 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wash Solution</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>1 vial (2000 U)</td>
 <td>20 U/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>100 mg</td>
 <td>125 digestion units/mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C9891</td>
 <td>This is Clostridium collagenase.
Bovine pancreatic collagenase would likely work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NCTC-135</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>Add FBS to 10%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel invasion chambers</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354481</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M9163</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 &mu;m Cell strainer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>22363549</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibody to cytokeratin 7</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>M7018</td>
 <td>Used at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Equipment Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.

isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay

नाल भ्रूण के लिए परिवहन, पोषक तत्वों, गैस, और वृद्धि कारकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कचरे के उन्मूलन के लिए जिम्मेदार है. इस प्रकार, placental विकास में दोष भ्रूण और माँ के लिए महत्वपूर्ण परिणाम है, और भ्रूण मारक का एक प्रमुख कारण हैं. नाल के भ्रूण भाग के प्रमुख सेल प्रकार ट्रोफोब्लास्ट है. प्राथमिक माउस अपरा ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं सामान्य और असामान्य placental विकास के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं, और सेल लाइनों के विपरीत है और अलग गर्भावस्था के विशिष्ट चरणों में ट्रोफोब्लास्ट का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों से ट्रोफोब्लास्ट की प्राथमिक संस्कृतियों placental कोशिकाओं में विशेष जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल द्वारा Thordarson एट अल विवरण पर आधारित है. 1, जिसमें एक percoll ढाल करने के लिए पृथक माउस placentas से एक अपेक्षाकृत शुद्ध ट्रोफोब्लास्ट सेल की आबादी को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह अधिक व्यापक रूप से उपयोग करने के लिए समान हैमानव ट्रोफोब्लास्ट सेल अलगाव 2-3 के लिए विकास के तरीकों. पवित्रता 7 cytokeratin 4 के लिए अलग कक्षों की immunocytochemical धुंधला हो जाना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ, अलग कक्षों तो एक Matrigel आक्रमण परख का उपयोग करने के लिए इन विट्रो 5-6 में ट्रोफोब्लास्ट invasiveness का आकलन विश्लेषण कर रहे हैं. कोशिकाओं पर आक्रमण और गिनती के लिए immunocytochemistry दाग से विश्लेषण कर रहे हैं.

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Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

इस प्रोटोकॉल में, हम d10.5 गर्भावस्था, ट्रोफोब्लास्ट एक Percoll ढाल का उपयोग कोशिकाओं के अलगाव के बाद पर माउस से अपरा के विच्छेदन का वर्णन. हम तो एक Matrigel आक्रमण परख में अलग कोशिकाओं के उपयोग के प्रदर्शन.

प्राथमिक माउस ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं और ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण परख के अलगाव

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Blastocysts से माउस ट्रोफोब्लास्ट स्टेम सेल की व्युत्पत्ति

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

अलगाव और चूहा यकृत कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

प्राथमिक ट्यूमर से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

माउस प्राथमिक अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

सीधे लेबल जांच का प्रयोग मजबूत 3 डी डीएनए मछली

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

माउस और मानव आंतों के ऊतकों से प्राथमिक myofibroblasts का अलगाव

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

अलगाव और माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

नवजात और वयस्क माउस त्वचा से प्राथमिक माउस केराटिनोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

अलगाव, लक्षण वर्णन, और माउस प्राथमिक गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के उच्च प्रवाह Extracellular फ्लक्स विश्लेषण

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

अलगाव और लघु सूअर से प्राथमिक महाधमनी Endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...