Name: isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay at JoVE.com

著者らは、このビデオを制作し、ミズーリ大学学術支援センターでクリエイティブサービスチームに感謝したいと思います。この作品は、国立衛生研究所の母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所、助成番号HD055231によってサポートされていました

1。マウス胎盤の解剖<ol><li> マウスの交配のペアを設定します。 </li><li>次の日のそれぞれで、膣栓の有無をチェックする。プラグインが検出された日は0.5日後に性交（DPC）7とみなされます。 </li><li>胎盤は、d 10.5成熟胎盤の発達と胎盤可能初めのクリーン郭清を、妊娠の所望の段階で収集することができる。ここでは、14.5 DPCを実証している。指定されたボリュームで、...

<ol>
	<li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion.">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li><li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta:+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening.">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li><li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts.">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li><li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion.">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

このビデオでは、マウスの胎盤から栄養膜細胞の単離を示しています。次に、栄養膜侵入のためのin vitroアッセイを示しています。この手順を用いて、主にではなく、完全に、栄養膜細胞の純粋な集団を得ることができる。さらに純度が要求されている場合は、一次ヒト栄養膜細胞のために記載されているように、磁性ビーズ分離またはフローサイトメトリーは、実行することができる。コ?...

Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
<table border='1'>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>50ml</td>
 <td>1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>2.383 g</td>
 <td>0.02M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sodium bicarbonate</td>
 <td>0.42 g</td>
 <td>0.01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicllin-Streptomycin</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>100 U- 100 &mu;g /ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile dH20</td>
 <td>to 500 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wash Solution</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>1 vial (2000 U)</td>
 <td>20 U/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>100 mg</td>
 <td>125 digestion units/mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C9891</td>
 <td>This is Clostridium collagenase.
Bovine pancreatic collagenase would likely work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NCTC-135</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>Add FBS to 10%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel invasion chambers</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354481</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M9163</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 &mu;m Cell strainer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>22363549</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibody to cytokeratin 7</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>M7018</td>
 <td>Used at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Equipment Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.

isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay

胎盤は、胎児への栄養、ガスや成長因子の輸送だけでなく、廃棄物の除去を担当しています。したがって、胎盤発育における欠陥は胎児と母親のための重要な結果を持っており、胚性致死の主な原因です。胎盤の胎児部分の主要な細胞型は栄養です。初代マウス胎盤栄養膜細胞は、正常および異常な胎盤の発達を研究するための有用なツールであり、細胞株とは異なり、単離され、妊娠の特定の段階で栄養を研究するために使用することができる。また、トランスジェニックマウスからの栄養膜細胞の初代培養を胎盤細胞中の特定の遺伝子の役割を研究するために用いることができる。ここで紹介するプロトコルはThordarson らの説明に基づいています。パーコール勾配が単離したマウスの胎盤から比較的純粋な栄養膜細胞集団を得るために使用されている1。それは、より広く使用するために類似しています人間の栄養膜細胞単離2-3 dの方法。純度は、サイトケラチン7 4の単離された細胞の免疫細胞化学的染色によって評価することができる。ここでは、単離された細胞は、その後、 体外 5-6 に栄養膜侵襲性を評価するために、マトリゲル浸潤アッセイを用いて分析する。浸潤細胞をカウントするための免疫細胞化学及び染色によって分析される。

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Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

このプロトコルでは、パーコール勾配を用いた栄養膜細胞の分離に続いて妊娠d10.5、上のマウスから胎盤の解剖について説明します。次に、マトリゲル浸潤アッセイで単離された細胞の使用例を示します。

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

原発腫瘍から免疫細胞の分離

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

ミニチュアブタからの原発性大動脈内皮細胞の単離と培養

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...