Name: isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay at JoVE.com

저자는이 비디오를 제작 미주리 학술 지원 센터의 대학에서 크리에이티브 서비스 팀에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 보건원의 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소, 교부금 번호 HD055231에 의해 지원되었다

1. 마우스 태반의 해부 <ol><li> 마우스의 결합 쌍을 설정합니다. </li><li> 다음과 같은 일의 각에서 copulatory 플러그의 존재를 확인합니다. 플러그가 감지되는 날은 0.5 일 이후의 성교 (dpc) 7 간주됩니다. </li><li> 태반은 D 10.5에 성숙 태반의 발달과 태반 가능한 시작의 깨끗한 절개로, 임신의 원하는 단계에서 수집 될 수 있습니다. 여기, 우리는 14.5 dpc을 보여줍니다. 주어진 볼륨에?...

<ol>
	<li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion.">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li><li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta:+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening.">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li><li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts.">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li><li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion.">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

이 동영상에서는, 우리는 마우스 태반에서 trophoblast 세포의 절연을 보여줍니다. 우리는 trophoblast의 침략에의 시험 관내 분석을 보여줍니다. 이 절차를 사용은 크게,하지만 완전히 trophoblast 세포의 순수한 인구는 얻을 수 있습니다. 더 순도가 필요한 경우 기본 인간 trophoblast 세포에 대한 설명 되었기 때문에, 자기 비드 분리 또는 유동 세포 계측법은 수행 할 수 있습니다. collagenase 분리 단계의 적절?...

Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
<table border='1'>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>50ml</td>
 <td>1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>2.383 g</td>
 <td>0.02M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sodium bicarbonate</td>
 <td>0.42 g</td>
 <td>0.01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicllin-Streptomycin</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>100 U- 100 &mu;g /ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile dH20</td>
 <td>to 500 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wash Solution</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>1 vial (2000 U)</td>
 <td>20 U/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>100 mg</td>
 <td>125 digestion units/mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C9891</td>
 <td>This is Clostridium collagenase.
Bovine pancreatic collagenase would likely work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NCTC-135</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>Add FBS to 10%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel invasion chambers</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354481</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M9163</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 &mu;m Cell strainer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>22363549</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibody to cytokeratin 7</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>M7018</td>
 <td>Used at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Equipment Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.

isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay

태반은 태아에게 영양분, 가스 및 성장 요인의 운송뿐만 아니라 폐기물의 제거를 담당하고 있습니다. 따라서, 태반 개발에 결함이 태아와 어머니에 대한 중요한 결과를 가지고 있고, 배아 lethality의 주요 원인입니다. 태반의 태아 부분의 주요 세포 유형은 trophoblast입니다. 기본 마우스 태반 trophoblast 세포는 정상과 비정상 태반 개발을 공부에 유용한 도구이며, 세포 라인과는 달리, 격리 및 임신의 특정 단계에서 trophoblast을 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 유전자 변형 생쥐에서 trophoblast의 주 문화는 태반 세포에서 특정 유전자의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 Thordarson 외하여 설명에 따라 달라집니다. percoll 기울기는 절연 마우스 태반에서 비교적 순수한 trophoblast 세포 인구를 얻기 위해 사용되는 1. 그것은 더 널리 사용하는 유사합니다인간 trophoblast 세포 절연 2-3에 D 방법. 순도는 cytokeratin 7 4에 대한 격리 세포의 immunocytochemical 착색에 의해 평가 될 수 있습니다. 여기서, 절연 셀은 다음 체외 5-6에 trophoblast의 invasiveness을 평가하기 위해 matrigel 침공 분석을 사용하여 분석하고 있습니다. 침입 세포는 계산에 대한 immunocytochemistry과 스테인드에 의해 분석됩니다.

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Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

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연구

생물학

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