Name: isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay at JoVE.com

Yazarlar bu videoyu üretti Missouri Akademik Destek Merkezi Üniversitesi Yaratıcı Hizmetler ekibi teşekkür etmek isterdim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü, hibe sayısı HD055231 tarafından desteklenmiştir

1. Fare plasentanın Diseksiyon <ol><li> Farelerde çiftleşme çiftleri ayarlayın. </li><li> İlerleyen günlerde her birinde, bir çiftleşme fiş varlığını kontrol edin. Bir fiş tespit edildiği gün 0.5 gün sonrası cinsel birleşme (DPC), 7. olarak kabul edilir. </li><li> Plasentası d 10.5 olgun plasentanın gelişimi ile plasenta mümkün başında temiz bir diseksiyon ile, gebeliğin istenen aşamada toplanabilir. Burada, 14.5 DPC göstermektedir. Verilen miktarlar ise, 10.5 ...

<ol>
	<li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion.">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li><li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta:+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening.">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li><li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts.">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li><li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion.">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

Bu video olarak, fare plasenta trofoblast hücrelerin izolasyonu göstermektedir. Biz sonra trofoblast invazyonu için in vitro deney göstermektedir. Bu prosedür kullanıldığında, büyük ölçüde tamamen olmasa da, trofoblast hücre saf nüfus elde edilebilir. Daha fazla saflık gerekli ise primer insan trofoblast hücreleri için tarif edildiği gibi, manyetik boncuk ayırma ya da akış sitometrisi, yapılabilmektedir. Kollajenaz ayrışma adımın doğru uzunluğu her bir deney ile tespit edilmeli ve deneyimi ...

Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
<table border='1'>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>50ml</td>
 <td>1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>2.383 g</td>
 <td>0.02M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sodium bicarbonate</td>
 <td>0.42 g</td>
 <td>0.01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicllin-Streptomycin</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>100 U- 100 &mu;g /ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile dH20</td>
 <td>to 500 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wash Solution</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>1 vial (2000 U)</td>
 <td>20 U/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>100 mg</td>
 <td>125 digestion units/mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C9891</td>
 <td>This is Clostridium collagenase.
Bovine pancreatic collagenase would likely work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NCTC-135</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>Add FBS to 10%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel invasion chambers</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354481</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M9163</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 &mu;m Cell strainer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>22363549</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibody to cytokeratin 7</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>M7018</td>
 <td>Used at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Equipment Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.

isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay

Plasenta fetusun besin, gazlar ve büyüme faktörlerinin taşıma yanı sıra, atıkların ortadan kaldırılması için sorumludur. Böylece, plasental gelişim kusurları, anne ve fetus için önemli sonuçları vardır ve embriyonik ölümcül önemli bir nedenidir. Plasenta fetal kısmının başlıca bir hücre türüdürler trofoblast olup. Birincil fare plasental trofoblast hücreleri normal ve anormal plasental geliştirme çalışmaları için yararlı bir araçtır, ve hücre çizgileri, farklı olarak, izole edilmiş ve hamilelik belirli aşamalarında trofoblast incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, transgenik fareler trofoblast primer kültürlerden plasental hücreleri içinde belirli genlerin rolü incelemek için kullanılabilir. Burada sunulan protokol Thordarson ve arkadaşları tarafından açıklama esas alınmaktadır. Bir Percoll gradient izole edilmiş fare plasentası gelen, saf bir trofoblast hücre popülasyonu elde etmek için kullanıldığı, 1,. Bu, daha yaygın olarak kullanmak için benzerİnsan trofoblast hücre izolasyonu 2-3 d yöntemleri. Saflık sitokeratin 7 4 için izole hücrelerin immünohistokimyasal boyama ile değerlendirilebilir. Burada, izole hücreler daha sonra in vitro 5-6 trofoblast invazivlik değerlendirmek için bir Matrigel işgali testi kullanılarak analiz edilmiştir. Işgal hücrelerin sayımı için immünsitokimya ve lekeli tarafından analiz edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...