Name: chromatographic purification of highly active yeast ribosomes
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes at JoVE.com

نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر Dinman ، بما في ذلك Belew أشتون ، جاك كارين ، Musalga Sharmishtha ، Sulima سيرجي ريدي شيفاني ، ومايكل Rhodin لما قدموه من مساعدة والمساهمة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل عن طريق منح لصباحا من جمعية القلب الأمريكية (AHA 0630163N) وJDD من المعاهد الوطنية للصحة (5R01 GM058859 - 12). وأيد جال قبل إعادة الاستثمار الأميركي وقانون الانتعاش عام 2009 تكملة لمنح الأم (3R01GM058859 - 11S1).

1. اتهم إعداد السيستين Sulfolink الراتنج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Sulfolink الراتنج (بيرس) في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ما مجموعه 10 مل من الطين 50 ٪ من هلام Sulfolink اقتران كما تم توفيره من قبل الشركة المصنعة في اثنين من قوارير ...

<ol>
	<li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+microsomes;+an+integrated+morphological+and+biochemical+study.">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li><li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes.">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li><li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli.">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li><li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns.">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li><li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis.">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li><li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system.">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li><li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria.">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li><li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+purity,+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method.">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li><li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast:+evidence+for+three+sites.">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis:+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains.">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li><li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells.">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li><li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes.">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li><li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein.">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li><li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae.">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li></ol>

بروتوكولات أساسية تشمل تنقية الريبوسوم الخلايا lysing وحصاد جزء من عصاري خلوي تدور بسرعة منخفضة ، والتكوير ثم ريبوسوم بواسطة الطرد المركزي بسرعة عالية 1. في حين تم استخدام أساليب الرواية قليلة لتنقية ريبوسوم البكتيرية ، وكان نفس لم ينطبق على حقيقيات النوى 2-4.</su...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Sulfolink الراتنج توصيلات </td><td> ثقب </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> حبة صغيرة الخافق 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> أوبتيما نابذة فائقة السرعة القصوى E </td><td> بيكمان كولتر </td><td></td></tr><tr><td> أسطورة RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 ملم الخرز الزجاجي </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> تريس </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 الكلورين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> ملغ (OAC) 2 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

ريبوسوم حقيقية النواة هي أكثر عطوب بالمقارنة مع نظرائهم eubacterial وarchael ، مما يشكل تحديا كبيرا للباحثين. مزعجا بشكل خاص هو حقيقة أن تحلل الخلايا النشرات عددا كبيرا من البروتياز وnucleases التي يمكن أن تتحلل ريبوسوم. وبالتالي ، فمن المهم لفصل ريبوسوم من هذه الإنزيمات في أسرع وقت ممكن. للأسف ، الطرق التقليدية تنبيذ فائق الفرق ريبوسوم يترك عرضة لهذه الانزيمات لفترات طويلة من الزمن بشكل غير مقبول ، مما يؤثر على سلامتها الهيكلية والوظيفية. لمعالجة هذه المشكلة ، ونحن استخدام أسلوب الكروماتوغرافي باستخدام السيستين اتهم Sulfolink الراتنج. هذا التطبيق بسيطة وسريعة يقلل بشكل ملحوظ شارك في أنشطة تنقية وnucleolytic بروتين ، وتنتج غلة عالية من سليمة ، ريبوسوم الخميرة النشطة كيميائيا للغاية. نقترح أن هذا الأسلوب يجب أن ينطبق أيضا على ريبوسوم الثدييات. بساطةالأسلوب ، والنقاء ، وتعزيز نشاط الريبوسوم المنقى chromatographically يمثل تقدما كبيرا التقنية لدراسة ريبوسوم حقيقية النواة.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes at JoVE.com

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

تلوث استعدادات حقيقية النواة ريبوسوم تنقيته بواسطة الطرق التقليدية التي شاركت في تنقية nucleases البروتياز ويؤثر سلبا على مجرى النهر التحاليل البيوكيميائية والهيكلية. ويتم استخدام أسلوب بسيط وسريع لتنقية الكروماتوغرافي لحل هذه المشكلة باستخدام الخميرة ريبوسوم كنظام النموذج.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

إعداد قلب فأر اقترن الارتحال الميتوكوندريا

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

عزلة ريبوسوم ترجمة المتضمن ببتيديل - tRNAs للتحليلات الوظيفية والهيكلية

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Yeast Colony Embedding Method

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

البروتين تنقية تقنية تسمح الكشف عن Sumoylation وUbiquitination من الناشيء الخميرة الحيز الحركي البروتينات Ndc10 وNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...