Name: chromatographic purification of highly active yeast ribosomes
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00
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Wir möchten alle Mitglieder der Dinman Labor, darunter Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, und Michael Rhodin für ihre Hilfe und Input bei diesem Projekt danken. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel unterstützt, von der American Heart Association (AHA 0630163N) AM und von den National Institutes of Health (5R01 GM058859-12) JDD. JAL wurde von einem amerikanischen Reinvestment and Recovery Act of 2009 Ergänzung zu den Eltern zu gewähren (3R01GM058859-11S1) unterstützt.

1. Erstellung eines Cystein berechnet SulfoLink Harz <ol><li> Bereiten SulfoLink Harz (Pierce) bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie insgesamt 10 ml einer 50% igen Aufschlämmung von SulfoLink Ultraschallgel, wie vom Hersteller in zwei 10 ml Kunststoff-Flaschen geliefert, mit 5 ml in jedes Fläschchen verteilt. </li><li> Kurz Zentrifuge Ampullen bei 850 xg und entfernen Sie vorsichtig Überstände. </li><li> Wash Gel dreimal in Bindungspuffer (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) durch Resuspendieren der Beads in 5 ml, ku...

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	<li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+microsomes;+an+integrated+morphological+and+biochemical+study.">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li><li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes.">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li><li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli.">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li><li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns.">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li><li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes.">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li><li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein.">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li><li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae.">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li></ol>

Ribosomen Aufreinigungsprotokolle grundsätzlich um Zellen zu lysieren, die Ernte einer cytosolischen Fraktion aus einer niedrigen Geschwindigkeit drehen, und dann Pelletierung Ribosomen durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation 1. Während ein paar neue Methoden zur Reinigung von bakteriellen Ribosomen verwendet wurden, hatte das gleiche nicht für Eukaryoten 2-4 wahr. Obwohl zusätzliche Schritte im Laufe der Jahre, wie zB Salz wäscht, und Glycerin Kissen (siehe zB 5) hinzugefügt word...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> SulfoLink Coupling Harz </td><td> Durchstechen </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini Bead-Beater 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E Ultrazentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Legend RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Glasperlen </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

Eukaryotischen Ribosomen sind sehr viel labiler als ihre eubakterielle und archael Pendants verglichen, so dass damit eine bedeutende Herausforderung für die Forscher. Besonders störend ist die Tatsache, dass die Lyse von Zellen eine große Anzahl von Proteasen und Nukleasen, die Ribosomen abbauen können Releases. Daher ist es wichtig, dass Ribosomen aus dieser Enzyme so schnell wie möglich zu trennen. Leider lässt herkömmlicher Differenzialsperren Ultrazentrifugation Methoden Ribosomen, die mit diesen Enzymen für unvertretbar lange Zeiträume, die Einfluss auf die strukturelle Integrität und Funktionalität. Um dieses Problem anzugehen, setzen wir ein chromatographisches Verfahren mit einem Cystein berechnet SulfoLink Harz. Diese einfache und schnelle Anwendung deutlich reduziert Co-Reinigung proteolytische und nucleolytischen Aktivitäten, hohe Erträge von intakten, sehr biochemisch aktive Hefe Ribosomen. Wir schlagen vor, dass diese Methode auch anwendbar sein Säugetier-Ribosomen. Die Einfachheit derdie Methode und die verstärkte Reinheit und Aktivität der chromatographisch gereinigten Ribosomen stellt einen bedeutenden technischen Fortschritt für das Studium der eukaryotischen Ribosomen.

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Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Yeast Colony Embedding Method

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...