Name: chromatographic purification of highly active yeast ribosomes
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00
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我々はこのプロジェクトで彼らの助けと入力用のアシュトンブリュー、カレンジャック、Sharmishtha Musalga、セルゲイSulima、シヴァーニレディ、そしてマイケルRhodin含むDinmanの研究室のメンバーのすべてを、感謝します。この作品は、米国心臓協会（AHA 0630163N）からAMにと国立衛生研究所（5R01 GM058859 - 12）からしてくれたための補助金によって支えられている。 JALは、親の助成金から2009サプリメントのアメリカの再投資および回復法（3R01GM058859 - 11S1）によってサポートされていました。

1。 Sulfolink樹脂の帯電システインの準備<ol><li>室温でSulfolink樹脂（Pierce）を準備します。 </li><li>各バイアルに分散5mlで、として2 10ミリリットルのプラスチックバイアルの製造元によって提供されるSulfolinkカップリングゲルの50％のスラリーを10mlの合計を置きます。 </li><li>簡単に言えば850 × gでバイアルを遠心し、注意深く上清を取り除く。 </li><li> 、5mlにビーズを再懸濁XGの850℃を軽く遠心...

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	<li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+microsomes;+an+integrated+morphological+and+biochemical+study.">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li><li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes.">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li><li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli.">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li><li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns.">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li><li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes.">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li><li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein.">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li><li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae.">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li></ol>

リボソームの精製プロトコルは基本的に低速のスピンからサ ​​イトゾル画分を収穫し、溶解細胞が関与し、高速遠心分離1によってリボソームをペレット化。いくつかの新規な方法は細菌のリボソームを精製するのに使用されているが、同じことが真核生物2〜4真されていませんでした。追加の手順が長年、例えば塩の洗浄、およびグリセロールのクッション（例えば5?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> Sulfolinkカップリング樹脂</td><td>ピアース</td><td> 20402 </td></tr><tr><td>ミニビーズビーター16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td>オプティママックスE超遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td></tr><tr><td>レジェンドRT </td><td>ソーバル</td><td></td></tr><tr><td> 0.5 mmのガラスビーズ</td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Clを </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9434 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 60128 </td></tr><tr><td> MG（OAC）2 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 221473 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5516 </td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

真核生物のリボソームは、このように研究者に大きな課題を投げかけ、はるかに不安定な彼らの真正細菌とarchaelの対応と比較しています。特に厄介な細胞の溶解は、リボソームを低下させる可能性プロテアーゼおよびヌクレアーゼの多数のリリースという事実です。従って、それは可能な限り迅速にこれらの酵素からリボソームを分離することが重要です。残念ながら、従来の差動遠心分離法は、それらの構造的完全性と機能性に影響を与える、時間の許容できないほど長時間、これらの酵素にさらされるリボソームを残します。この問題に対処するため、我々はSulfolink樹脂充電システインを使用してクロマトグラフィー法を利用しています。このシンプルかつ迅速なアプリケーションが大幅にそのまま、非常に生化学的にアクティブ酵母のリボソームの高収量の生産、CO浄化のタンパク質分解と核酸分解活性を低減します。我々は、このメソッドはまた、哺乳動物リボソームに適用されるべきことを示唆している。のシンプルさクロマトグラフィーで精製したリボソームの方法、および強化された純度と活性は、真核生物のリボソームの研究のための重要な技術的進歩を表しています。

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Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

CO浄化ヌクレアーゼ及びプロテアーゼによって従来の方法で精製した真核生物リボソームの調製品の汚染は否定的に下流の生化学的および構造解析に影響を与えます。迅速かつ簡単なクロマトグラフィー精製法は、モデル系として、酵母のリボソームを使用してこの問題を解決するために使用されます。

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

酵母細胞からミトコンドリアの精製

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

ミトコンドリアは密結合のラットの心臓の準備

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Yeast Colony Embedding Method

酵母のコロニーの埋め込み法

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...