Name: chromatographic purification of highly active yeast ribosomes
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Dinman, в том числе Эштон Белью, Карен Джек, Sharmishtha Musalga, Сергей Сулима, Шивани Редди, и Майкл Родин за их помощь и информацию по этому проекту. Эта работа была поддержана грантами А. М. от Американской ассоциации сердца (AHA 0630163N) и JDD из Национального института здоровья (5R01 GM058859-12). JAL была поддержана американской реинвестирования и восстановлению Закон 2009 года дополнением к родителю гранта (3R01GM058859-11S1).

1. Подготовка цистеина взимается Sulfolink смолы <ol><li> Подготовка Sulfolink смолы (Pierce) при комнатной температуре. </li><li> Место в общей сложности 10 мл 50% суспензии Sulfolink связи гель, поставляемые производителем в двух 10 мл пластиковые пробирки с 5 мл распределяется в каждом флаконе. </li><li> Кратко цент...

<ol>
	<li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+microsomes;+an+integrated+morphological+and+biochemical+study.">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li><li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes.">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li><li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli.">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li><li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns.">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li><li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis.">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li><li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system.">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li><li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria.">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li><li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+purity,+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method.">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li><li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast:+evidence+for+three+sites.">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis:+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains.">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li><li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells.">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li><li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes.">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li><li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein.">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li><li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae.">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li></ol>

Рибосома протоколы очистки в основном связаны с лизису клеток, уборка цитозольного фракции низкой скорости вращения, а затем гранулирования рибосомы высокой скорости центрифугирования 1. Хотя несколько новых методов были использованы для очистки бактериальных рибосом, то же не...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Sulfolink Муфта смолы </td><td> Прокалывать </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Мини шарик для взбивания 16 </td><td> БИОСПЕК </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Оптима Макс E ультрацентрифуге </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Легенда РТ </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 мм Стеклянные бусы </td><td> БИОСПЕК </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Трис </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> ЭДТА </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> КОН </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Глицерин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Пуромицин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

Эукариотической рибосомы являются гораздо более лабильны по сравнению с их эубактерий и archael коллег, что создает серьезную проблему для исследователей. Особенно беспокойство тот факт, что лизис клетки-релизы большое количество протеаз и нуклеаз, которые могут ухудшить рибосом. Таким образом, важно, чтобы отдельные рибосом из этих ферментов как можно быстрее. К сожалению, обычные методы дифференциального центрифугирования листьев рибосомы подвергаются воздействию этих ферментов для неприемлемо длительных периодов времени, воздействуя на их структурной целостности и функциональности. Для решения этой проблемы, мы используем хроматографический метод с использованием цистеин взимается Sulfolink смолы. Это простое и быстрое применение значительно снижает совместно очистки протеолитических и nucleolytic деятельность, производя высокие урожаи нетронутыми, высоко биохимически активные рибосомы дрожжей. Мы полагаем, что этот метод должен быть применим и к млекопитающим рибосом. Простотаметод, и расширение чистоты и активности хроматографически очищенный рибосома представляет собой значительный технический прогресс в изучении эукариотических рибосом.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes at JoVE.com

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Загрязнение подготовки эукариотических рибосом очищают традиционными методами путем совместной очистки нуклеаз и протеаз отрицательно влияет на течение биохимических и структурных анализов. Быстрый и простой хроматографический метод очистки используется для решения этой проблемы с помощью дрожжей рибосомы в качестве модельной системы.

Хроматографической очистки высокоактивной рибосомы дрожжей

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Очистка Митохондрии из дрожжей Клетки

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Подготовке высококвалифицированных Связанные сердце крысы Митохондрии

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК на функциональные и структурные анализы

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Yeast Colony Embedding Method

Дрожжи колонии Вложение Метод

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em&gt; Кишечная палочка</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...