Name: chromatographic purification of highly active yeast ribosomes
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes at JoVE.com

Ashton Belew, Karen Jack Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima Shivani Reddy ve onların yardım ve bu projenin giriş Michael Rhodin Dinman laboratuvar üyeleri, teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AHA 0630163N), AM ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (5R01 GM058859-12) JDD bağışları ile destek verdi. JAL, 2009 ek ana hibe bir Amerikan Yatırım ve Kurtarma Yasası (3R01GM058859-11S1) tarafından desteklenmiştir.

1. Bir sistein hazırlanması Sulfolink reçine ücret <ol><li> Oda sıcaklığında Sulfolink reçine (Pierce) hazırlayın. </li><li> Her bir şişenin içine dağıtılan 5 ml, 10 ml% 50 olarak iki adet 10 ml plastik şişeleri, üretici tarafından sağlanan Sulfolink kaplin jel bulamaç toplam yerleştirin. </li><li> Kısaca 850 xg&#39;de şişeleri santrifüj ve dikkatle süpernatantlar kaldırmak. </li><li> 5 ml boncuklar resuspending xg 850 kısaca santrifüj ve pipet ile süpernatantı çıkarmadan kaplin tam...

<ol>
	<li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+microsomes;+an+integrated+morphological+and+biochemical+study.">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li><li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes.">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li><li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli.">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li><li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns.">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li><li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis.">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li><li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system.">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li><li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria.">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li><li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+purity,+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method.">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li><li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast:+evidence+for+three+sites.">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis:+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains.">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li><li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells.">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li><li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes.">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li><li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein.">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li><li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae.">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li></ol>

Ribozom arıtma protokolleri temelde düşük hızda spin sitozolik bir fraksiyonu hasat parçalama hücreleri içerir ve daha sonra yüksek hızda santrifüj 1 ribozomlar peletleme . Bakteri ribozomları temizlemek için bir kaç yeni yöntemler kullanılmış olsa da, aynı ökaryotlar 2-4 için doğru değildi. Maya ribozomlar biyokimyasal ve yapısal çalışmalar ek adımlar yaş, örneğin tuz yıkama ve gliserol minderler (örneğin: 5) boyunca eklenmiş olmasına rağmen, büyük...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sulfolink Kaplin reçine </td><td> Delmek </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini boncuk-çırpıcı 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Legend RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Cam boncuklar </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (oac) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

Ökaryotik ribozomlar, böylece araştırmacılar için önemli bir meydan okuma poz eubacterial ve archael muadillerine göre çok daha dayanıksız. Özellikle sorunlu hücrelerin parçalanması, proteaz ve ribozomlar düşürebilir nükleazlar çok sayıda serbest olduğu bir gerçektir. Bu nedenle, mümkün olduğunca çabuk bu enzimler ribozom ayırmak için önemlidir. Ne yazık ki, geleneksel diferansiyel Ultrasantrifügasyon yöntemleri, yapısal bütünlüğünü ve işlevselliğini etkileyen bu enzimler zaman kabul edilemeyecek kadar uzun süre maruz ribozomlar bırakır. Bu sorunu çözmek için, bir sistein ücret Sulfolink reçine kullanarak kromatografik yöntem kullanmaktadır. Bu basit ve hızlı uygulama, sağlam, yüksek biyokimyasal aktif maya ribozomların yüksek verim üreten ortak arıtma proteolitik ve nucleolytic faaliyetleri, önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem aynı zamanda memeli ribozomlar için geçerli olması gerektiğini düşündürmektedir. Sadeliğiyöntemi ve ökaryotik ribozomlar çalışma için önemli bir teknik ilerleme, kromatografik saflaştırılmış ribozom gelişmiş saflık ve aktivite gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes at JoVE.com

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Ortak arıtma nükleazlar ve proteazlar tarafından geleneksel yöntemlerle saflaştırılmış ökaryotik ribozomlar hazırlıkları kontaminasyonu mansap biyokimyasal ve yapısal analizleri olumsuz etkiler. Maya ribozomlar bir model sistem olarak kullanarak bu sorunu çözmek için basit ve hızlı bir kromatografik saflaştırma yöntemi kullanılır.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Yeast Colony Embedding Method

Maya Colony Gömme Yöntemi

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...