Name: application of a mouse ligated peyer&#x2019;s patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by m cells
Uploaded: 2011-12-17T14:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei allen EIB-Mitglieder für die Entwicklung dieser Technik zu danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Grant-in-Aid for Scientific Research auf Priority Areas &quot;Membrane Traffic&quot; (HO) und &quot;Matrix of Infectious Phenomena&quot; (KH), Young Scientists (SF und KH) und Wissenschaftliche Forschung (HO unterstützt ) und Scientific Research on Innovative Areas &quot;Intrazelluläre Logistik&quot; (HO), vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan.

1. Vorbereitung von Bakterienzellen <ol><li> Streak Glycerin gefüllt fluoreszierende Bakterien (z. B. GFP-exprimierenden S. typhimurium) auf LB-Agar-Platte mit 100 ug / ml Ampicillin. </li><li> Kultur einer einzelnen Kolonie von LB-Agar über Nacht in 2 ml der neuen LB-Medium. </li><li> 0,5 ml Bakterienkultur zu 4,5 ml der neuen LB-Medium und Inkubation bis optischen Dichte von 1,0 bei 600 nm erreicht ist. </li><li> Ernte Bakterienzellen durch Zentrifugation (3.000 xg, 5 min, 4 ° C). </li><li> Überstand ve...

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	<li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+IgA+synthesis:+regulation+of+front-line+body+defences.">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).</li><li>Hapfelmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+microbial+colonization+of+germ-free+mice+reveals+the+dynamics+of+IgA+immune+responses.">Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses.</a> Science. 328, 1705-1709 (2010).</li><li>Owen, R. L., Jones, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+specialization+within+human+Peyer's+patches:+an+ultrastructural+study+of+intestinal+lymphoid+follicles.">Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles.</a> Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).</li><li>Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissues.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues.</a> Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Hase, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH(+)+bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response.">Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462, 226-230 (2009).</li><li>Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteropathogenicity+of+Escherichia+coli.+I.+Evaluation+of+mouse+intestinal+loops.">Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops.</a> Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).</li><li>Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M+cell+transport+of+Vibrio+cholerae+from+the+intestinal+lumen+into+Peyer's+patches:+a+mechanism+for+antigen+sampling+and+for+microbial+transepithelial+migration.">M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration.</a> J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).</li><li>Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M+cells--entryways+of+opportunity+for+enteropathogens.">M cells--entryways of opportunity for enteropathogens.</a> J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).</li><li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer's+patch+M+cells.">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).</li><li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium,+Listeria+monocytogenes,+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer's+patches.">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).</li><li>Nagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Peyer's+patches+in+the+induction+of+Helicobacter+pylori-induced+gastritis.">Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).</li></ol>

<html> Die Inkubationszeit von ligiert Peyer-Patch mit Bakteriensuspension ist in der Regel für 1 Stunde, um die bakterielle Einbau in M-Zellen zu beobachten. Im Falle von 4 Stunden Inkubation werden die Bakterien oft in der T-Zell-Zone der Peyer-Plaques nachgewiesen. Wie das verdampfte Isofluran inhalant Anästhesie halten konnte Mäusen stabil ist, ist die Inkubationszeit von ligiert Peyer-Patch mit Bakteriensuspension erweiterbar, um die Bakterien, die in T-Zell-Zone in die Peyer-Patch bewegen zu beobachten. Der wich...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> LB Agar Ampicillin- 100 </td><td> SIGMA </td><td> L5667 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 mono-Reactive Dye-Pack </td><td> GE Healthcare </td><td> PA23001 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 Carbonsäure, Succinimidylester </td><td> Invitrogen </td><td> A10168 </td><td></td></tr><tr><td> Inhalationsnarkose Apparat </td><td> Shinano Seisakusho </td><td> SN-487 </td><td></td></tr><tr><td> Fixation und Permeabilisierung Lösung </td><td> BD </td><td> 554722 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus Glycoprotein 2 Antikörper </td><td> MBL </td><td>D278-3 </td><td> 200-facher Verdünnung (5μg/ml) </td></tr><tr><td> Goat Anti-Rat IgG, F (ab &#39;) 2-Fragment spezifisch </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 112-505-006 </td><td> 200-facher Verdünnung (20μg/ml) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 633 Phalloidin </td><td> Molecular Probes </td><td> A22284 </td><td> 50-facher Verdünnung </td></tr><tr><td> Konfokalen Laser Scanning-Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMIRE2 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Restaurierung Dekonvolution Mikroskop </td><td> Applied Precision </td><td> DeltaVision Core- </td><td></td></tr></tbody></table>

application of a mouse ligated peyer&#x2019;s patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by m cells

Das Innere unseres Darms ist mit enormen Anzahl von symbiotischer Bakterien besiedelt. Die Schleimhautoberfläche des Magen-Darm-Trakt ist ständig mit ihnen und gelegentlich, um Krankheitserreger ausgesetzt. Der Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) spielen eine Schlüsselrolle für die Induktion der mukosalen Immunantwort auf diese Mikroben 1, 2. Zur Initiierung der mukosalen Immunantwort, muss die Schleimhautzellen Antigene aus dem Darmlumen in das Epithel in organisierte lymphoide Follikel, wie Peyer-Plaques transportiert werden. Dieses Antigen Transzytose wird von spezialisierten epithelialen Zellen M 3, 4 vermittelt. M-Zellen sind atypische Epithelzellen, die sich aktiv phagozytieren Makromoleküle und Mikroben. Im Gegensatz zu dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen, die Ziel-Antigene zu Lysosomen zum Abbau, M-Zellen hauptsächlich transcytose die verinnerlichten Antigene. Diese kräftige makromolekularen Transzytose durch M-Zellen liefert Antigen auf die zugrunde liegende organisierte lymphoide Follikel eind ist vermutlich wesentlich für die Einleitung Antigen-spezifische mukosale Immunantworten. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Förderung dieses Antigen-Aufnahme durch M-Zellen weitgehend unbekannt. Wir haben bereits berichtet, dass Glykoprotein 2 (GP2), insbesondere auf der apikalen Plasmamembran der M-Zellen unter Enterozyten exprimiert, als transcytotic Rezeptor für eine Teilmenge von Kommensalen und pathogene Enterobakterien, darunter Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. typhimurium dient ), durch die Anerkennung FimH, eine Komponente des Typ-I-Pili auf der bakteriellen äußeren Membran 5. Hier stellen wir eine Methode für die Anwendung einer Maus Peyer-Patch Darmschlinge Test auf bakterielle Aufnahme durch M-Zellen zu bewerten. Diese Methode ist eine verbesserte Version der Maus Darmschlinge Assay zuvor beschriebenen 6, 7. Die verbesserte Punkte sind wie folgt: 1. Isofluran wurde als Narkotikum verwendet. 2. Etwa 1 cm ligiert Darmschlinge einschließlichIng. Peyer-Patch wurde eingerichtet. 3. Bakterien durch M-Zellen aufgenommen wurden Fluoreszenz durch Fluoreszenzmarkierung Reagenz oder durch Überexpression fluoreszierenden Proteins, wie grün fluoreszierende Protein (GFP) markiert. 4. M-Zellen in der Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Patch wurden von insgesamt-mount immunostainig mit anti Gp2 Antikörper nachgewiesen. 5. Fluoreszierende Bakterien Transzytose von M-Zellen wurden durch konfokale mikroskopische Analyse beobachtet. Die Maus Peyer-Patch Darmschlinge Test liefern könnte die Antwort, welche Art von Kommensalen oder pathogenen Bakterien durch M-Zellen transcytosed und kann uns dazu bringen, den molekularen Mechanismus, wie mukosalen Immunsystems durch M-Zellen zu stimulieren verstehen.

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Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M-Zellen in einem spezialisierten Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Plaques eine wichtige Rolle spielen für die Schleimhaut Immunüberwachung im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir die Auswertungsverfahren für die bakterielle Transzytose von M-Zellen<em&gt; In vivo</em&gt;. Diese Methode stellt eine Methode zur M-Zell-Funktion im Immunsystem zu verstehen.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...