Name: application of a mouse ligated peyer&#x2019;s patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by m cells
Uploaded: 2011-12-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of a Mouse Ligated PeyerÃ¢â‚¬â„¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells at JoVE.com

Författarna vill tacka alla EIB-medlemmar för att utveckla denna teknik. Denna forskning stöds delvis av Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning på prioriterade områden &quot;Membrane Traffic&quot; (HO) och &quot;Matrix över smittsamma fenomen&quot; (KH), Unga Forskare (SF och KH), och vetenskaplig forskning (HO ), och vetenskaplig forskning om innovativa områden &quot;Intracellulär Logistics&quot; (HO), från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan.

1. Beredning av bakterieceller <ol><li> Streak glycerol lager fluorescerande bakterier (såsom GFP uttrycka S. Typhimurium) på LB en agarplatta som innehåller 100 mikrogram / ​​ml ampicillin. </li><li> Kultur en enda koloni från LB agar övernattning i 2 ml nytt LB medium. </li><li> Tillsätt 0,5 ml bakteriekultur till 4,5 ml av nya LB medium och inkubera tills optisk densitet på 1,0 vid 600 nm är nådd. </li><li> Harvest bakterieceller genom centrifugering (3000 xgi, 5 min, 4 ° C). </li><li> Kasser...

<ol>
	<li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+IgA+synthesis:+regulation+of+front-line+body+defences.">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).</li><li>Hapfelmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+microbial+colonization+of+germ-free+mice+reveals+the+dynamics+of+IgA+immune+responses.">Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses.</a> Science. 328, 1705-1709 (2010).</li><li>Owen, R. L., Jones, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+specialization+within+human+Peyer's+patches:+an+ultrastructural+study+of+intestinal+lymphoid+follicles.">Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles.</a> Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).</li><li>Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissues.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues.</a> Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Hase, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH(+)+bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response.">Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462, 226-230 (2009).</li><li>Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteropathogenicity+of+Escherichia+coli.+I.+Evaluation+of+mouse+intestinal+loops.">Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops.</a> Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).</li><li>Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M+cell+transport+of+Vibrio+cholerae+from+the+intestinal+lumen+into+Peyer's+patches:+a+mechanism+for+antigen+sampling+and+for+microbial+transepithelial+migration.">M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration.</a> J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).</li><li>Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M+cells--entryways+of+opportunity+for+enteropathogens.">M cells--entryways of opportunity for enteropathogens.</a> J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).</li><li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer's+patch+M+cells.">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).</li><li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium,+Listeria+monocytogenes,+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer's+patches.">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).</li><li>Nagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Peyer's+patches+in+the+induction+of+Helicobacter+pylori-induced+gastritis.">Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).</li></ol>

<html> Inkubationstiden för knyts ihop Peyer s plåster med bakteriesuspension är oftast under 1 timme för att observera den bakteriella införlivas i M-celler. Vid 4 timmar inkubation är de bakterier som ofta upptäcks i T-cell zon Peyers plack. Som den förångade isofluran inhalant anestesi kunde hålla möss stabil, är inkubationstiden för knyts ihop Peyer s plåster med bakteriesuspension utdragbar att observera de bakterier som flyttar in i T-cells zonen i Peyer s patch. Det viktiga i detta experiment är att...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (tillval) </th></tr><tr><td> LB-agar Ampicillin- 100 </td><td> SIGMA </td><td> L5667 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 mono-reaktivt Dye Pack </td><td> GE Healthcare </td><td> PA23001 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 karboxylsyra, succinimidyl ester </td><td> Invitrogen </td><td> A10168 </td><td></td></tr><tr><td> Inhalationsanestesi apparater </td><td> Shinano Seisakusho </td><td> SN-487 </td><td></td></tr><tr><td> Fixering och Permeabilization Lösning </td><td> BD </td><td> 554.722 </td><td></td></tr><tr><td> Anti mus Glykoprotein 2 antikropp </td><td> MBL </td><td>D278-3 </td><td> 200-faldig utspädning (5μg/ml) </td></tr><tr><td> Get-anti-Rat IgG, F (ab &#39;) 2 fragment specifika </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 112-505-006 </td><td> 200-faldig utspädning (20μg/ml) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 633 Phalloidin </td><td> Molekylära sonder </td><td> A22284 </td><td> 50-faldig utspädning </td></tr><tr><td> Konfokala laser scanning mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMIRE2 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Restaurering deconvolution mikroskop </td><td> Tillämpad Precision </td><td> DeltaVision Kärna </td><td></td></tr></tbody></table>

application of a mouse ligated peyer&#x2019;s patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by m cells

Insidan av våra tarmar är bebodda med enorma antal bakteriefloran. Den slemhinna i mag-tarmkanalen är ständigt utsatt för dem och ibland för patogener. Tarmen-associerad lymfvävnad (GALT) spelar en viktig roll för induktion av slemhinnor immunsvaret mot dessa mikrober 1, 2. Att inleda slemhinnor immunsvar, måste slemhinnor antigener transporteras från tarmen lumen över epiteliala barriären till organiserad lymfoida folliklar som Peyers plack. Detta antigen transcytos medieras av specialiserade epitelceller M celler 3, 4. M-celler är atypiska epitelceller som aktivt phagocytose makromolekyler och mikrober. Till skillnad från dendritiska celler (DC) och makrofager, som riktar antigener till lysosomer för nedbrytning, M celler transcytose främst internaliseras antigener. Denna kraftfulla makromolekulära transcytos genom M celler levererar antigen till den underliggande organiserade lymfoida folliklar end tros vara nödvändigt för att initiera antigenspecifika slemhinnor immunsvar. Men de molekylära mekanismer som främjar detta antigen upptag av M celler är i stort sett okända. Vi har tidigare rapporterat att glykoprotein 2 (GP2), särskilt uttryckt på den apikala plasmamembranet av M celler bland enterocyterna, fungerar som en transcytotic receptor för en delmängd av kommensala och patogena enterobakterier, inklusive Escherichia coli och Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), genom att erkänna FimH, en komponent av typ I Pili på bakteriens yttre membran 5. Här presenterar vi en metod för tillämpning av en mus Peyer är plåster intestinal loop-analys för att utvärdera bakteriell upptag av M celler. Denna metod är en förbättrad version av musen tarmen slingan test tidigare beskrivits 6, 7. Den förbättrade punkter är följande: 1. Isofluran användes som ett bedövningsmedel. 2. Ca 1 cm knyts ihop intestinal slinga inklusivening Peyer är patch bildades. 3. Bakterier tas upp av M cellerna fluorescerande av fluorescens märkning reagens eller genom att överuttryck av fluorescerande proteinet som grönt fluorescerande protein (GFP). 4. M celler i hårsäcken-associerade epitel täcker Peyer är plåster upptäcktes av hel-mount immunostainig med anti GP2 antikropp. 5. Fluorescerande bakterier transcytos av M celler observerades av konfokala mikroskopisk analys. Musen Peyer är plåster tarm loop-analysen kunde leverera svaret vilken typ av kommensala eller sjukdomsframkallande bakterier transcytosed av M celler, och kan leda oss att förstå den molekylära mekanismen för hur man kan stimulera slemhinnorna immunförsvaret genom M celler.

Watch this Scientific Journal Video about Application of a Mouse Ligated PeyerÃ¢â‚¬â„¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells at JoVE.com

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M celler i en specialiserad follikel-associerat epitel täcker Peyers plack spela en viktig roll för slemhinnorna immunosurveillance i tarm-associerad lymfvävnad. Här har vi beskrev utvärderingsmetod för bakteriell transcytos av M celler<em&gt; In vivo</em&gt;. Denna metod ger en metod för att förstå M-cellernas funktion i immunförsvaret.

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

En visuell analys för att övervaka T6SS-medierad bakteriell konkurrens

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Den kröslymfknutor Duct kanylerad Rat Model: Ansökan om bedömning av Intestinal Lymfatisk Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Tillämpning av Långsiktigt odlade Interferon-γ Enzymkopplad immunospot analys för bedömning Effector och Memory T-cellssvar hos nötkreatur

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Upptäcka Cortex Fragment Under Bacterial sporgroning

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescensanalys av stresskristallbildning efter bakteriell utmaning av däggdjursceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

En roman In Vitro Wound Healing analys för att utvärdera cellmigration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...