Name: visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition
Uploaded: 2011-12-22T12:00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition at JoVE.com

الإلكترون المجهري العمل في المختبر تشنغ هو الدعم جزئيا عن طريق المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (1R01GM082893 ، 1R01GM098672 ، 1S10RR026814 - 01 وP50GM082250 (ألف لفرانكل)) ، ومنحة من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية الاختراق ، وجائزة الفرص وجائزة التكنولوجيا الجديدة.

<ol>
	<li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy.">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes.">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases.">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li><li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li><li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure,+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli.">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li><li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li><li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations.">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ملون سلبي EM هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لدراسة هياكل 3D عينات البروتين المنقى ، مثل استخدام الميل المخروطية عشوائي 8 الأسلوب ، الأمر الذي يتطلب جمع زوج من الصور مع واحدة من العينة يميل إلى 60 درجة واحد من نفس المنطقة لكن untilted ، لحساب إعادة بناء المجمعات 3D الجزيئات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تلطيخ السلبية EM والعديد من التطبيقات الأخرى ، مثل الكشف عن بلورات (2D) ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء 9 ، تصور مجمعات البروتين في التشكل مختلفة 10 ، أو لمجرد تصور التجانس و / أو عدم تجانس تنقية البروتينات عينة هكذا توفير التغذية المرتدة لتحسين إجراءات تنقية البروتين ، وما يمكن أن يكون قويا لفحص الكيمياء الحيوية. في هذه المقالة ، قدمنا ​​البروتوكولات بدءا من إعداد شبكات الكربون المغلفة لجمع عينات من الصور الملطخة سلبا البروتين في المجهر الالكتروني. كما هو موضح هنا ،هذا الإجراء هو بسيط وسهل وليس لاحقا. إذا محاولة حساب 3D اعادة البناء من العينة العشوائية التي يرصدها أسلوب الميل المخروطية ، فمن الضروري الحصول على صور الزوج الميل. ومع ذلك ، إذا كان أداء واحدة تحليل الجسيمات هو الغرض ، وصور متعددة untilted تكفي. في كلتا الحالتين ، مطلوب مزيد من معالجة الصور ، وهذا هو خارج نطاق هذه المقالة الفيديو. كما هو الحال مع أي أسلوب ، هناك اختلافات في البروتوكولات. فورمات اليورانيل يعمل بشكل جيد جدا وكاشف وصمة سلبية في معظم الحالات. خلات اليورانيل آخر استخداما كاشف صمة سلبية. يعمل مشابهة جدا لفورمات اليورانيل ، ولكن مع حجم أكبر من الحبوب ، وفي كثير من الحالات ، وانخفاض النقيض من فورمات اليورانيل. وميزة استخدام خلات اليورانيل هو أن يستمر لفترة أطول من الحل فورمات اليورانيل. لا يحتاج المرء أن يعد حلا جديد كل أسبوع واحد أو اثنين. كلا فورمات اليورانيل وخلات حمضية. مصدر قلق واضح هو أنيمكن أن تحدث تغييرات انخفاض الرقم الهيدروجيني في العينة البروتين التي تجري دراستها. وصمة عار على كل من حلول وظيفة أيضا مثبتات البروتين. وقد أظهرت دراسة سابقة أن كلا من عينات البروتين 7 الإصلاح بسرعة. هذا التثبيت السريع يجعل انخفاض الرقم الهيدروجيني أقل أهمية. أثناء عملية التلوين ، وشمل عينة من البروتين تصبح ثابتة قبل انخفاض الرقم الهيدروجيني يمكن أن تحدث أي تغييرات. ومع ذلك ، قد الكواشف الأخرى صمة سلبية ، مثل موليبدات الأمونيوم وحمض الفسفوتنغستيك ، تحقق نتائج أفضل لتلطيخ عينات عند انخفاض الرقم الهيدروجيني هو مصدر قلق 7. كلا موليبدات الأمونيوم وحمض الفسفوتنغستيك لديها درجة الحموضة محايد تقريبا ، ولكن على النقيض من عينات البروتين التي تولدها هذه البقع عادة ما تكون أقل شأنا من فورمات اليورانيل.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الكولديون سائل دبق </td><td> علوم الإلكترون المجهري ، والسلطة الفلسطينية ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 12620-30 </td><td> 30ml ، 2 ٪ في خلات الأميل </td></tr><tr><td> النحاس المطلي الشبكات </td><td> تيد بيلا ، وشركة الولايات المتحدة الأمريكية. </td><td> G400/G200 </td><td> شبكة 400/200 </td></tr><tr><td> Cressington 208C السامية المغطي فراغ الكربون توربو </td><td> تيد بيلا ، وشركة الولايات المتحدة الأمريكية. </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> وأشار مزدوجة قضيب الكربون </td><td> تيد بيلا ، وشركة الولايات المتحدة الأمريكية. </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> اليورانيل فورمات </td><td> علوم الإلكترون المجهري ، والسلطة الفلسطينية ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 16984-59-1 </td><td> 99.9 ٪ النقاء </td></tr><tr><td> بيلكو نظام easiGlow GlowDischarge </td><td> Tالطبعة شركة بيلا ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 91000 </td><td> الشراء في الصيدليات المحلية </td></tr><tr><td> Whatman رقة تصفية # 1 </td><td> فيشر العلمية </td><td> 09 - 805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

أصبحت واحدة المجهر الإلكتروني الجسيمات (EM) ، على حد سواء سلبية أو المجمدة ملطخة العينات البيولوجية المائية ، وهو أداة متعددة الاستعمالات في مجال البيولوجيا البنيوية 1. في السنوات الأخيرة ، وحقق هذا الأسلوب نجاحا كبيرا في دراسة هياكل من البروتينات والجزيئات المجمعات 2 ، 3. مقارنة مع الإلكترون cryomicroscopy (cryoEM) ، التي هي جزء لا يتجزأ في العينات المجمدة البروتين المائية في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي 4 ، تلطيخ السلبية هو إعداد نموذج أبسط الطريقة التي هي جزء لا يتجزأ من البروتين في عينات من طبقة رقيقة من الملح المجفف لزيادة المعادن الثقيلة تباين العينة 5. في المقابل تعزيز صمة سلبية EM يسمح فحص العينات البيولوجية الصغيرة نسبيا. بالإضافة إلى تحديد ثلاثية الأبعاد (3D) بنية تنقية البروتينات أو المجمعات 6 البروتين ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لأغراض أوسع من ذلك بكثير. على سبيل المثال ، وصمة عار سلبية يمكن استخدامها بسهولة EM لتصور المنقىعينات من البروتين ، والحصول على معلومات مثل التجانس / تجانس العينة ، وتشكيل المجمعات البروتين أو التجمعات الكبيرة ، أو ببساطة لتقييم جودة إعداد البروتين. في هذه المقالة الفيديو ، نقدم بروتوكول كامل لاستخدام EM لمراقبة ملطخة سلبا على عينة من البروتين ، من إعداد شبكات الكربون المغلفة وصمة عار على EM السلبية لاكتساب صورة لنموذج ملون سلبا في مجهر الكتروني يعمل على تسريع 120kV الجهد. وقد استخدمت هذه البروتوكولات في مختبرنا عادة ويمكن اتباعها بسهولة من قبل المستخدمين المبتدئين.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition at JoVE.com

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

وقد أصبح البروتين تصور عينات بواسطة المجهر الإلكتروني السلبية وصمة عار (EM) شعبية طريقة التحليل البنيوي. ومن المفيد للتحليل الكمي الهيكلية ، مثل احتساب إعادة الإعمار 3D من الجزيئات التي تجري دراستها ، وكذلك لفحص النوعية نوعية التحضيرات البروتين. في هذه المقالة نقدم بروتوكولات تفصيلية لإعداد شبكات EM ، تلوين العينة وتصور العينة في المجهر الالكتروني. يمكن للمستخدمين المبتدئين اتبع بروتوكولات بسهولة وصمة عار على الاستفادة السلبية EM باعتباره فحص روتيني ، بالإضافة إلى فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى ، لتقييم عينات من البروتين.

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

تحسين 2D و 3D الجلد<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

إعداد وتوصيف Nanoliposomes لفخ البروتينات الكروية المائية النشطة بيولوجيا

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

استخدام علم المغنطيسية لمراقبة الدمج الخلوي والتحلل الحيوي اللاحق للجسيمات النانوية أكسيد الحديد المركب كيميائيا

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...