Name: high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

فإن الكتاب وأود أن أشكر Viksø نيلسن (Novozymes) للهدية من الانزيمات cellulolytic. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل FP7 التجديد والمشاريع التي BBSRC BB/G016178 وBB/G016194.

1. تحضير عينات نحن نعمل عادة مع نابع إما من النباتات العشبية أو الخشبية. في حالة المواد العشبية التي تزرع النباتات لمرحلة النضج ، وبعد تطوير البذور الجافة التي نجمعها ينبع الشيخوخة حالما يكتمل. ومقطعة الى شرائح ينبع 4 ملم ، ووضعها في قارورة 2 مل مع كرات طحن الثلاثة. في حالة المواد الخشبية ، هي الأرض العينات الى نشارة الخشب الخشنة مع مسار ملف الخشب ومن ثم وضعها في طاحونة الكرة لمزيد من المعالجة. توضع العينات في رفوف داخل طحن / تنسيق محطة (الشكل 1). هذه المحطة يطحن بالتسلسل ، يمزج ، ويزن كل عينة. تم تأسيس عدد من التكرار المطلوبة لكل عينة عن طريق اختبار مواد الأرض في سلسلة من التجارب الأولية ، حيث يتم تحديد التباين الجوهرية لحجم الجسيمات معينة. واخترقت قارورة سعة 2 في القاع ، ويتم الاستغناء عن المواد التي اهتزاز القارورة أكثر من البئر المحدد. يتم التحكم في ذراع تهتز من ردود الفعل من رصيد يسمح لصرفها دقيقة من المسحوق. الروبوت يوزع 4 ملغ / جيد في التحليل القياسي وهناك حاجة إلى 4 التكرار في الحالات القصوى. هذا يسمح بتحليل عينات من النبات 20 / لوحة. 2. المعالجة مرة واحدة يتم تنسيق العينات ، يتم تجهيزها لوحات 96 - جيدا من قبل نظام تداول الآلي السائل (الشكل 2). هنا يتم تنفيذ المعالجة خفيفة على المواد النباتية من خلال إضافة 350 ميليلتر من حمض أو حلول القلوية والتدفئة لوحة على كتلة تكييفها. لتجنب التبخر خلال التحليل ، وأغلقت 96 لوحات جيدا مع مات السيليكون. يمكن تعديل درجة الحرارة ووقت المعالجة وفقا للمواد التي تجري دراستها. درجة الحرارة القصوى ، مع ذلك ، هي 100 درجة مئوية. إجراء بديل لاختبار أشد المعالجة المسبقة هو يمهد للمعالجة المواد خارج الخط ، والقضاء على pretreatmet من العملية. 3. تحليل بالماء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد المواد سابقة التجهيز ، والروبوت يزيل تلقائيا حل المعالجة ، ويغسل ، وجميع الآبار ، و 5 مرات مع 850 ميكرولتر 25 ملم مخزن خلات. يتم تنفيذ يشطف بها مضيفا العازلة في حل المعالجة ، وإزالة لاحقا 50 ٪ من حجم التداول الكلي بعد السماح للمواد الصلبة في العينة إلى تسوية. تم تعيين ذروة الطموح في نصف كتلة السائل لتجنب الشفط المواد الصلبة من قاع البئر ، وليس هناك خسارة ضئيلة من المواد الصلبة باستخدام هذا النهج. بعد هذه يغسل جيدا في درجة الحموضة 4.5 والمواد مستعد لالإنزيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف خليط يحتوي على انزيم حل السليلوزات وhemicellulases بواسطة الروبوت. في كل بئر ، يتم الاستغناء عن 850 ميليلتر من مزيج الأنزيم ، وانتقل إلى لوحة حاضنة 50 درجة مئوية الهز. يتم تنفيذ التحلل القياسية لمدة 8 ساعات ، ولكن يمكن تكييف هذه المرة لغرض التجربة. التحميل انزيم القياسية المستخدمة في الأعشاب هو 7 FPU / غرام من المادة. </li></ol> 4. الكشف عن السكريات المختزلة تم تنفيذ التصميم للحد من السكريات أفرج عنه بعد التحلل باستخدام تعديل 3 - 2 - الميثيل benzothiazolinone hydrozone (MTBH) الأسلوب 3. وقد تم اختيار MBTH والأسلوب الأكثر مناسبة لأنه كان أسهل لأتمتة وأقل عرضة للتداخل من المركبات مثل البروتينات. نحن تعديل هذه الطريقة شديدة الحساسية للاستخدام على منصة الروبوت بحيث يمكن قياسها كميا بدقة في تركيزات السكريات الموجودة في hydrolysates الكتلة الحيوية ، مع حجم النهائي من 250 ميكرولتر الذي هو مناسبة ل96 لوحة ضوئية قياسية أيضا. يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية تلقائيا وتم تنفيذ ثلاثة قرارات مستقلة عن الحد من السكريات لكل فعل تسكر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد التقطت 30 ميكرولتر من حلامة من لوحة البئر العميق ومختلطة مع 45 ميكرولتر من 25 ملم خلات الصوديوم العازلة في صفيحة متجنب 96 PCR جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إضافة 25 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1N و 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على 0.43 ملغم / لتر و 0.14 MBTH DTT ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خلط ، كانت ساخنة لوحة PCR عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في thermocycler أو جهاز مشابه يسلم بالضبط نفس الكمية من الحرارة إلى جميع الآبار 96. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل ردود الفعل الناتجة إلى لوحة ضوئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من كاشف المؤكسدة (0.2 ٪ FeNH4 (SO4) 2 ، حامض Sulfamic 0.2 ٪ و 0.1 ٪ حمض الهيدروكلوريك). تخلط جيدا وتترك لتطوير ما لا يقل عن 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب على كل لوحة تحتوي أيضا على مستوى ردود الفعل nmol 50 ، 100 و 150 nmol nmol الجلوكوز. قراءة في لوحات ضوئية 620 نانومتر. </li></ol> 5. ممثل النتائج : وتعرض أمثلة على أنواع مختلفة من التحليلات في الشكل 3 و 4. تم الحصول على جميع النتائج باستخدام منصة الآلي. الشكل 3 إعادةويعرض زيادة في الحد من السكريات اصدره حضانات ح 8 من الحور الأرض مع كميات متزايدة من الانزيمات cellulolytic. الشكل 4 يقدم آثار الحمضية والقلوية المعالجة على عينات الحور. هيدروكسيد الصوديوم في المعالجة هي أكثر كفاءة من أن تضعف H2SO4 المعالجة في تسهيل الافراج عن السكريات خلال التحلل. وتقاس كمية من السكريات بعد التحلل النقصان عندما يتم تنفيذ المعالجة باستخدام تركيزات أعلى من هيدروكسيد الصوديوم 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. محطة الروبوتية لطحن و 96 تنسيق جيد من الكتلة الحيوية <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. محطة مناولة السائل لتحليل الإنتاجية العالية تسكر <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تأثير أحمال مختلفة على انزيم الافراج عن تخفيض حكمه السكر من عينات الحور <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. تأثير المعالجة المسبقة المختلفة على عينات من الحور تسكر. السكريات ألف أفرج عنه بعد pretreament مع نسب مختلفة من H2SO4 عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. السكريات باء أفرج عنه بعد المعالجة المسبقة هيدروكسيد الصوديوم في نفس درجة الحرارة والوقت من حمض المعالجة .

<ol>
	<li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses.">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li><li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass:+the+writing's+on+the+walls.">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li><li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li><li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials.">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> طحن ويزن الروبوت </td><td> Labman أتمتة </td><td></td></tr><tr><td> 2 مل الأنبوب الصغير مع قبعات </td><td> Sarstedt المحدودة </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 ملم حبات الفولاذ المقاوم للصدأ </td><td> Qiagen المحدودة </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene مربع لوحات تخزين جيد </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> طولكرم - 050 - 050C </td></tr><tr><td> Whatman حصيرة سقف لوحات جيدا مربع 96 </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> السائل hanling الروبوت </td><td> Tecan المجموعة المحدودة </td><td> الحرية ايفو 200 </td></tr><tr><td> حمض الكبريتيك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> BPE359 - 500 </td></tr><tr><td> خلات الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S8750 - 500G </td></tr><tr><td> حامض الخليك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 كذلك لوحات PCR تنورة كامل </td><td> Sarstedt المحدودة </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3 - 2 - الميثيل benzothiazolinone هيدرات هيدرازون هيدروكلوريد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 129739 - 25G </td></tr><tr><td> DL - dithiothreitol </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D9163 - 1G </td></tr><tr><td> كورنينج microplate 96 مسطحة القاع جيدا </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> TKT - 521 - 050H </td></tr><tr><td> dodecahydrate الامونيوم سلفات الحديد (III) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F1668 - 250G </td></tr><tr><td> Sulfamic حمض </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 242772 - 500G </td></tr><tr><td> حامض الهيدروكلوريك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials

ويمكن تقسيم السكريات التي تشكل الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic وصولا الى انتاج مجموعة من السكريات التي يمكن استخدامها لاحقا في إنشاء معامل تكرير أحيائية. وهذه الخامات تشكل منصة الصناعية الجديدة ، وهما أمران غير المستدامة ومحايدة الكربون ، لتحل محل الاعتماد الحالي على الوقود الأحفوري. تنتج تمردات لتفكيك المواد التي لوحظت في الخصائص الذاتية التي lignocellulosic العديد من جدران الخلايا النباتية. السليلوز البلورية مضمن في مصفوفة مثل السكريات وxylans arabinoxylans ، والهيكل كله المغطى من قبل الفينولية البوليمر اللجنين ، وهذا هو أيضا صعبة الهضم 1. من أجل تحسين هضم المواد النباتية نحن بحاجة لاكتشاف الاختناقات الرئيسية لتسكر من جدران الخلايا ومتحولة أيضا شاشة تربية والسكان لتقييم التغير في تسكر 2. هذه المهام تتطلب نهجا إنتاجية عالية ، وهنا نقدم منصة التحليلية التي يمكن القيام بتحليل التسكير في شكل لوحة 96 - جيدا. وقد تم تطوير هذا النظام الأساسي للسماح للفحص هضم lignocellulose أعداد كبيرة من السكان من الأنواع النباتية المختلفة. وقلصت نحن باستمرار حجم رد فعل لمعالجة مسبقة لطيف ، الإنزيمية جزئية والتصميم والسكر ، والسماح لأعداد كبيرة بسرعة المقررة في النظام الآلي. هذا البرنامج يعمل آليا مع كميات مليغرام من الكتلة الحيوية ، وأداء طحن الكرة في ظل ظروف خاضعة للرقابة للحد من المواد النباتية إلى حجم الجسيمات بطريقة موحدة استنساخه. مرة واحدة على عينات من الأرض ، والروبوت الآلي التنسيق يوزع كميات محددة من المواد وسجلت في المقابل من الآبار بئر عميقة لوحة 96 (الشكل 1). عادة ، ونحن الاستغناء عن نفس المادة الى 4 آبار لدينا 4 يعيد للتحليل. مرة واحدة تملأ اللوحات مع المواد النباتية في التخطيط المطلوب ، يتم نقل يدويا لأنها محطة معالجة السائل (الشكل 2). في هذه المحطة التي يتعرض لها عينات إلى المعالجة إما خفيفة مع حمض مخفف أو القلوية وحضنت في درجة حرارة تصل إلى 90 درجة مئوية. بعد ذلك تتم إزالة الحل المعالجة وتشطف العينات مع عازلة لإعادتهم إلى درجة الحموضة مناسبة للالمائي. ثم يتم تحضين العينات مع مزيج الانزيم لفترة من الزمن المتغير عند 50 درجة مئوية. يؤخذ على قسامة من حلامة تلقائيا ، ونحن مصممون على خفض السكريات الأسلوب MBTH اللونية.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

يوصف بسيطة ، طريقة سريعة لتحديد إمكانية تسكر أعداد كبيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. النظام الأساسي لهذا التحليل الآلي ينطوي على إعداد الكتلة الحيوية النباتية للتحليل في 96 لوحات جيدة وأداء لاحقة من التحلل ، المعالجة وتقدير من السكريات الافراج عنهم.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

الكشف عن أهداف ميرنا في إنتاجية عالية باستخدام الفحص 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...