Name: high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות Viksø-נילסן (Novozymes) על המתנה של האנזימים cellulolytic. עבודה זו מומנה על ידי חידוש FP7 ועל ידי פרויקטים BBSRC BB/G016178 ו BB/G016194.

1. הכנת הדגימות בדרך כלל אנחנו עובדים עם נובעת עשבוניים או צמחים עציים. במקרה של חומרים עשבוניים אנו גדלים הצמחים לפדיון, לאחר התפתחות הזרע שאנו אוספים נובעת יבש פעם הזדקנות תושלם. נובעת הן קצוץ לתוך 4 חלקים מ&quot;מ להציב 2 בקבוקוני מ&quot;ל עם שלושה כדורים כרסום. במקרה של חומרים וודי, הדגימות הם הקרקע נסורת גס עם קובץ עץ כמובן ולאחר מכן להציב טחנת כדור לעיבוד נוסף. דגימות ממוקמות במעמד בתוך שחיקה / עיצוב התחנה (איור 1). תחנה זו ברצף טוחן, מערבב, ושוקל כל המדגם. מספר החזרות הדרוש לדגימה היא הוקמה על ידי בדיקת חומר הקרקע בסדרה של ניסויים ראשוניים בהם השתנות פנימי בגודל חלקיק מסוים נקבע. 2 בקבוקוני מ&quot;ל הם דקרו בתחתית ואת החומרים לוותר על הרטט של הבקבוקון על כן נבחר. הזרוע רוטט נשלטת על ידי משוב מן האיזון המאפשר מחלק מדויקת של אבקה. הרובוט dispenses 4 מ&quot;ג / גם בניתוח רגיל 4 חזרות יש צורך ברוב המקרים. זה מאפשר 20 דגימות צמח / צלחת להיות מנותח. 2. Pretreatment לאחר דגימות מעוצבות, הצלחות 96-מעובדים היטב על ידי מערכת טיפול אוטומטי נוזלי (איור 2). הנה המקדים קלה מתבצע על ידי הוספת חומרים צמח 350 μL של חומצה או אלקליין פתרונות וחימום את הצלחת על גוש מותאם. כדי למנוע אידוי במהלך הניתוח, 96 צלחות חתומות היטב עם מאט סיליקון. הטמפרטורה וזמן טיפול מקדים יכול להיות שונה על פי החומרים הנלמד. הטמפרטורה המקסימלית, לעומת זאת, היא 100 ° C. הליך חלופי לבדיקה pretreatments קשים היא pretreat החומרים מעל הקו ולבטל את pretreatmet מן התהליך. 3. הידרוליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי החומרים הם pretreated, הרובוט מסיר אוטומטית את הפתרון המקדים, ושוטף, כל הבארות, 5 פעמים עם 850 μL הצפת Acetate 25 מ&quot;מ. שטיפות מתבצעת על ידי הוספת מאגר לפתרון לפני הטיפול, ולאחר מכן הסרת 50% מהנפח הכולל לאחר המאפשר מוצקים במדגם להתיישב. גובה השאיפה מוגדר מחצית מסת הנוזל, כדי למנוע aspirating מוצקים מתחתית הבאר, יש הפסד זניח של מוצקים באמצעות גישה זו. אחרי אלו רוחץ את ה-pH בבאר הוא 4.5 ואת החומר מוכן הידרוליזה אנזימטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת המכילה אנזים פתרון של cellulases ו hemicellulases נוסף על ידי הרובוט. לתוך כל טוב, 850 μL של תערובת האנזים הוא חילק את צלחת מועבר לתוך 50 ° C רועד חממה. הידרוליזה הסטנדרטי הוא ביצע עבור 8 שעות, אבל הפעם יכול להיות מותאם לצורך הניסוי. טעינת אנזים הסטנדרטית המשמשת עבור עשבים הוא 7 FPU / g של חומר. </li></ol> 4. איתור של הפחתת סוכרים קביעת הפחתת סוכרים שוחרר לאחר הידרוליזה בוצעה באמצעות שונה 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) שיטה 3. MBTH נבחרה השיטה המתאימה ביותר כי זה היה הכי קל להפוך את רגישים פחות להפרעות תרכובות כגון חלבונים. שינינו את השיטה רגישה מאוד לשימוש בפלטפורמת רובוטית, כך שזה יכול לכמת במדויק את ריכוזי סוכרים נוכח hydrolysates ביומסה, עם נפח סופי של 250 μL אשר מתאים צלחת תקן 96 אופטי טוב. כל הפעולות הבאות נעשות באופן אוטומטי ושלושה קביעות עצמאית של הפחתת סוכרים בוצעו עבור כל תגובה saccharification. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 μL של hydrolyzate נלקח הצלחת היטב עמוקה מהולה μL 45 של 25 חיץ נתרן אצטט מ&quot;מ צלחת עקפה 96 PCR היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μL של NaOH 1N ו - 50 μl של תמיסה המכילה 0.43 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​MBTH ו 0.14 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DTT נוספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב, הצלחת PCR היה מחומם על 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב thermocycler או מכשיר דומה אשר מספקת בדיוק את אותה כמות של חום לכל 96 בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה וכתוצאה מכך הועבר צלחת אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מגיב oxidising (0.2% FeNH4 (SO4) 2, Sulfamic Acid 0.2% ו 0.1% HCl). מערבבים היטב ולהשאיר לפתח לפחות 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת כל צריך להכיל גם תגובות תקן של 50 nmol, 100 ו - 150 nmol גלוקוז nmol. הצלחות אופטיים לקרוא 620 ננומטר. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמאות לסוגים שונים של ניתוחים מוצגות באיור 3 ו -4. כל התוצאות התקבלו באמצעות פלטפורמה אוטומטית. איור 3 מחדשמציג את העלייה הפחתת סוכרים שפורסמו על ידי 8 incubations h מ צפצפה הקרקע עם כמויות גדלות והולכות של אנזימים cellulolytic. איור 4 מציג את ההשפעות של חומצה המקדים אלקליין על דגימות צפצפה. טיפול מקדים NaOH הוא יעיל יותר כי המקדים בדילול H2SO4 בקידום שחרורו של סוכרים במהלך הידרוליזה. הסכום של סוכרים נמדד לאחר הידרוליזה פוחתת כאשר המקדים מבוצע באמצעות ריכוזים גבוהים יותר מאשר NaOH 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. לתחנת רובוטית עבור שחיקה 96 עיצוב טוב של ביומסה <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. לתחנת טיפול נוזלי עבור ניתוח תפוקה גבוהה saccharification <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. השפעת מקדמי אנזים שונה על שחרורו של הפחתת שווי סוכר ממדגמים צפצפה <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. השפעת pretreatments שונים saccharification של דגימות צפצפה. סוכרים א שוחרר לאחר pretreament עם אחוזים שונים של H2SO4 על 90 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. B. סוכרים שוחרר לאחר pretreatments NaOH בטמפרטורת הזמן אותו מאשר המקדים את החומצה .

<ol>
	<li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses.">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li><li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass:+the+writing's+on+the+walls.">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li><li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li><li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials.">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li></ol>

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> גריסה &amp; במשקל רובוט </td><td> Labman אוטומציה </td><td></td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ל שפופרת מיקרו עם כובעים </td><td> Sarstedt בע&quot;מ </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ פלדה חרוזים חלד </td><td> Qiagen בע&quot;מ </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene מרובע גם צלחות אחסון </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> טול 050-050C </td></tr><tr><td> Whatman כובע מחצלת עבור 96 צלחות טוב מרובע </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Hanling נוזלי רובוט </td><td> טקאן גרופ בע&quot;מ </td><td> חופש Evo 200 </td></tr><tr><td> Sulphuric חומצה </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> נתרן אצטט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S8750-500 גרם </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 גם PCR צלחות חצאית מלאה </td><td> Sarstedt בע&quot;מ </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone מימה hydrochloride </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 129739-25 גרם </td></tr><tr><td> DL-dithiothreitol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> קורנינג microplate 96 קרקעית שטוחה טוב </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> אמוניום ברזל (III) סולפט dodecahydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F1668-250 </td></tr><tr><td> Sulfamic חומצה </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 242772-500 גרם </td></tr><tr><td> חומצת כלור </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials

סוכרים שמרכיבים ביומסה במפעל lignocellulosic יכול להיות שבור למטה כדי לייצר מגוון של סוכרים, כי לאחר מכן ניתן להשתמש הקמת biorefinery. אלה חומרי הגלם יהווה פלטפורמה התעשייה החדש, שהוא גם בר קיימא פחמן ניטרלי, כדי להחליף את התלות הנוכחי על דלק מאובנים. סרבנות על הדקונסטרוקציה שנצפתה חומרים lignocellulosic מופק על ידי מספר מאפיינים מהותיים של קירות תא הצמח. תאית הקריסטל מוטבע סוכרים כגון מטריקס ו xylans arabinoxylans, ואת המבנה כולו עטוף על ידי פנוליות הפולימר ליגנין, שהוא גם קשה לעיכול 1. כדי לשפר את העיכול של חומרי הצמח אנחנו צריכים לגלות את צווארי הבקבוק העיקריים saccharification של קירות התא וגם מוטציה מסך אוכלוסיות הרבייה להעריך את משונות saccharification 2. משימות אלה דורשות גישה תפוקה גבוהה וכאן אנו מציגים פלטפורמה אנליטית כי ניתן לבצע ניתוח saccharification בפורמט 96-היטב צלחת. פלטפורמה זו פותחה כדי לאפשר את הקרנת העיכול lignocellulose של אוכלוסיות גדולות של מיני צמחים שונים. יש לנו scaled למטה הכרכים תגובה עבור המקדים עדין, הידרוליזה אנזימטית חלקית ונחישות סוכר, כדי לאפשר במספרים גדולים כדי להעריך במהירות מערכת אוטומטית. זו פלטפורמה אוטומטית עובדת עם כמויות מיליגרם של ביומסה, ביצוע כרסום כדור בתנאים מבוקרים כדי לצמצם את חומרי צמח לגודל החלקיקים סטנדרטית באופן לשחזור. לאחר הדגימות הם הקרקע, הרובוט עיצוב אוטומטי dispenses הסכומים שצוינו נרשם חומר לתוך בארות המקביל צלחת 96 באר עמוקה (איור 1). בדרך כלל, אנו מחלקים את אותו חומר תוך 4 בארות יש 4 משכפל לניתוח. לאחר הצלחות מלאים בחומר צמח בפריסה הרצויה, הם מועברים באופן ידני לתחנת טיפול נוזלי (איור 2). בתחנה זו הדגימות כפופים המקדים קלה עם חומצה או לדלל או אלקליין מודגרות בטמפרטורות של עד 90 ° C. הפתרון המקדים יוסר לאחר מכן את הדגימות שטפה עם חיץ להחזיר אותם pH מתאים הידרוליזה. הדגימות מודגרת מכן בתערובת אנזים לאורך זמן משתנה של 50 ° C. Aliquot נלקח hydrolyzate לבין הפחתת סוכרים נקבעים באופן אוטומטי על ידי שיטת colorimetric MBTH.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...