Name: high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Viksø-Нильсен (Novozymes) за дар целлюлолитических ферментов. Эта работа финансировалась FP7 ОБНОВЛЕНИЕ и СИББН проектов BB/G016178 и BB/G016194.

1. Подготовка образцов Мы обычно работаем со стеблями, либо из травянистых или древесных растений. В случае травянистых материалов мы выращиваем растения до погашения, а после развития семян, которую мы собираем сухие стебли раз старения является полным. Стебли нарезанные на 4 сегмента мм и помещен в 2 мл флаконах с тремя шарами фрезерования. В случае древесных материалов, образцы измельчают до грубого опилки с файлом дрова и затем помещается в шаровой мельнице для дальнейшей обработки. Образцы помещают в стойку внутри шлифования / форматирование станции (рис. 1). Эта станция последовательно измельчает, смешивает, а вес каждого образца. Количество повторений необходимо на один образец устанавливается испытание измельченного материала в серии предварительных экспериментов, где внутренняя изменчивость определенного размера частицы определяется. 2 мл флаконы пронизаны на дне и материалы выдаются на вибрацию флакона по выбранному хорошо. Вибрирующей руке находится под контролем обратной связи от баланса позволяет точное дозирование порошка. Робот распределяет 4 мг / лунку в стандартный анализ и 4 повторений необходимы в большинстве случаев. Это позволяет 20 образцы растений / пластины для анализа. 2. Предварительная обработка Как только образцы отформатирован, 96-луночных обрабатывается автоматизированной системой обработки жидкости (рис. 2). Здесь мягкий предварительная обработка производится на растительных материалов путем добавления 350 мкл кислоты или щелочи и нагревания пластины на адаптированы блока. Чтобы избежать испарения при анализе 96-луночных уплотнены силиконовым матовым. Температуры и времени предварительной обработки может быть изменена в соответствии с материалами изучается. Максимальная температура, однако, составляет 100 ° C. Альтернативная процедура для тестирования жестких предварительной обработки является для предварительной обработки материалов в автономном режиме и устранения pretreatmet от процесса. 3. Гидролиз <ol><li> После предварительной обработке материалов, робот автоматически удаляет предварительной обработки решение, и моет, все колодцы, 5 раз с 850 мкл 25 мМ ацетатного буфера. Полоскания осуществляется путем добавления буфера для предварительной обработки решение, а затем удаление 50% от общего объема после учета твердых частиц в образце, чтобы обосноваться. Высота стремление устанавливается на половине массы жидкости, чтобы избежать аспирации твердых частиц от дна ямы, есть незначительная потеря твердых тел с помощью этого подхода. После этих моет рН в скважине составляет 4,5 и материал будет готов для ферментативного гидролиза. </li><li> Фермент смеси, содержащей решение целлюлазы и hemicellulases добавляется робота. В каждую лунку, 850 мкл фермента смесь разливают и пластина перемещается в 50 ° C пожимая инкубатора. Стандартный гидролиза проводят в течение 8 часов, но на этот раз может быть адаптирована к цели эксперимента. Стандартные загрузки фермент используется для трав составляет 7 FPU / г материала. </li></ol> 4. Определение редуцирующих сахаров Определение редуцирующих сахаров освобожден после гидролиза проводили с использованием модифицированной 3-метил-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) метод 3. MBTH был выбран как наиболее подходящий метод, потому что это был самый легкий для автоматизации и наименее чувствительны к помехам от соединения, такие как белки. Мы изменили это очень чувствительный метод для использования на платформе робота, чтобы он мог точно количественно сахара в концентрациях присутствует в биомассе гидролизатов, в конечном объеме 250 мкл, которая пригодна для стандартных оптических 96 ячейках. Все действия выполняются автоматически и три независимых определения редуцирующих сахаров проводились для каждой осахаривания реакции. <ol><li> 30 мкл гидролизата было взято из глубокого колодца пластины и смешивают с 45 мкл 25 мМ буферного раствора ацетата натрия в обогнул ПЦР 96-луночного планшета. </li><li> 25 мкл 1 н NaOH и 50 мкл раствора, содержащего 0,43 мг / мл MBTH и 0,14 мг / мл DTT были добавлены. </li><li> После смешивания пластины ПЦР нагревали при 60 ° С в течение 20 мин в амплификаторе или аналогичного устройства, которое обеспечивает именно такое же количество тепла, чтобы все 96 лунок. </li><li> Полученную реакционную был переведен в оптическом пластины. </li><li> Добавить 100 мкл окислительного реагента (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% сульфаминовой кислоты и 0,1% HCl). Хорошо перемешать и оставить развиваться, по крайней мере, 1 ч. </li><li> Каждая пластина должна также содержать стандартных реакций из 50 нмоль, 100 и 150 нмоль нмоль глюкозы. Оптические пластины читаются при 620 нм. </li></ol> 5. Представитель Результаты: Примеры различных видов анализа представлены на рисунке 3 и 4. Все результаты были получены с помощью автоматизированной платформы. Рисунок 3 повторнопредставляет увеличения редуцирующих сахаров выпущен на 8 ч инкубации с земли тополя с увеличением количества целлюлолитических ферментов. На рисунке 4 представлена ​​последствий кислых и щелочных предварительной обработки на тополь образцов. Предварительная обработка NaOH является более эффективным, что разбавленный H2SO4 предварительной обработки для облегчения выпуска сахара в процессе гидролиза. Количество сахара измеряется после гидролиза уменьшается при предварительной обработке осуществляется с помощью NaOH концентрациях выше 1М. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Роботизированная станция для шлифования и 96 также форматирование биомассы <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Жидкие станции обработки для анализа Высокая пропускная осахаривания <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Влияние различных нагрузках фермента об освобождении снижения сахара эквивалентов от тополя образцы <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Влияние различных предварительной обработки на осахаривания тополя образцов. А. Сахаров освобожден после pretreament с различными процент H2SO4 при 90 ° С в течение 30 минут. Б. Сахаров освобожден после предварительной обработки NaOH при той же температуре и времени, чем кислоты предварительной обработки .

<ol>
	<li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses.">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li><li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass:+the+writing's+on+the+walls.">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li><li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li><li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials.">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Шлифовальные и весом робот </td><td> Labman Автоматизация </td><td></td></tr><tr><td> 2 мл микро трубку с колпачками </td><td> Sarstedt ООО </td><td> 72,694 </td></tr><tr><td> 5 мм шарики из нержавеющей стали </td><td> Qiagen ООО </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene квадратных пластин и хранения </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TUL-050-050C </td></tr><tr><td> Ватман шапка коврик для 96 квадратных луночных </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Жидкие робот hanling </td><td> Tecan Группа ООО </td><td> Свобода Evo 200 </td></tr><tr><td> Серная кислота </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> Едкий натр </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> Ацетат натрия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8750-500G </td></tr><tr><td> Уксусная кислота </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96-PCR полной пластин юбки </td><td> Sarstedt ООО </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-метил-2-benzothiazolinone гидразона гидрохлорид гидрат </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 129 739-25G </td></tr><tr><td> DL-дитиотреитол </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> Corning планшет 96 лунок плоским дном </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> ТКТ-521-050H </td></tr><tr><td> Аммоний железо (III) сульфат dodecahydrate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1668-250G </td></tr><tr><td> Сульфаминовая кислота </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 242772-500G </td></tr><tr><td> Соляная кислота </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials

Полисахариды, входящие в состав завода лигноцеллюлозных биомассы можно разбить, чтобы произвести ряд сахаров, которые впоследствии могут быть использованы в создании переработке биологических веществ. Это сырье будет представлять собой новую производственную площадку, которая одновременно устойчивым и нейтральным уровнем эмиссии углерода, приходящая на смену текущей зависимости от ископаемых видов топлива. Непокорностью к деконструкции наблюдается в лигноцеллюлозных материалов производится несколькими внутренними свойствами стен растительной клетки. Кристаллическая целлюлоза встроен в матрицу полисахариды, такие как xylans и arabinoxylans, и вся конструкция заключена по фенольных полимер лигнин, который также трудно переварить 1. С целью улучшения усвояемости растительных материалов, мы должны обнаружить основные препятствия для осахаривания клеточных стенок, а также экран мутанта и гнездящихся популяций для оценки изменчивости осахаривания 2. Эти задачи требуют высокой пропускной способности и подход здесь мы представляем аналитическую платформу, которая может выполнять осахаривания анализа в 96-луночный планшет формата. Эта платформа была разработана для скрининга лигноцеллюлозы усвояемость большой численностью населения от различных видов растений. Мы сократили объемы реакции для щадящей предварительной обработки, частичная ферментативного гидролиза и сахар решимости, чтобы позволить больших количествах, чтобы оценить быстро в автоматизированной системе. Это автоматизированная платформа работает с миллиграмм количество биомассы, выполняя мяч фрезерные в контролируемых условиях для снижения растительных материалов для стандартизированного размера частиц в воспроизводимым образом. Как только образцы земли, автоматизированный робот, форматирование обходится определены и записаны количество материала в соответствующие лунки по 96 глубоких скважин пластины (рис. 1). Как правило, мы обойтись и тот же материал на 4 скважинах иметь 4 повторяет для анализа. После пластин заполнены растительного материала в нужный макет, они вручную переместить на жидком станции обработки (рис. 2). В этой станции образцы подвергаются предварительной обработке мягкой либо с разбавленной кислотой или щелочной и инкубировали при температуре до 90 ° C. Предварительная обработка решение последовательно удаляется и образцы промывали буфером для их возвращения в подходящий рН для гидролиза. Затем образцы инкубировали с ферментом смеси для переменной времени при температуре 50 ° C. Аликвоту берется из гидролизатов и редуцирующих сахаров, автоматически определяется MBTH колориметрическим методом.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Простой, быстрый метод определения осахаривания потенциал большого числа образцов растительной биомассы описывается. Автоматизированная платформа для данного анализа заключается в подготовке растительной биомассы для анализа в 96-луночных и последующего выполнения предварительной обработки, гидролиз и количественное определение сахара освобождены.

Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

РНК предсказание вторичной Структура Использование высоких-пропускная способность SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Высокая пропускная Титрование люциферазы экспрессирующих рекомбинантные вирусы

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Восстановление взрослых данио сердца для высокой пропускной приложений

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Обнаружение микроРНК цели в высокой пропускной Использование 3&#39;LIFE Пробирной

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Высокая пропускная способность<em&gt; Данио Rerio</em&gt; Анализ Расход энергии

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...