Name: monitoring equilibrium changes in rna structure by 'peroxidative' and 'oxidative' hydroxyl radical footprinting
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting at JoVE.com

وأيد هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة RO1 - GM085130 والمؤسسة الوطنية للعلوم MCB0929394. نشكر الدكتور ماريون شميت لضيافتها وعلى السماح لنا الفيلم في مختبرها.

1. إعداد الكواشف Footprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد رد فعل 10X العازلة التي تحتوي على 100 ملي كاكوديلات الصوديوم ، EDTA 1 مم ، و 1 بوكل M. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تصفية العازلة باستخدام خلات 0.2 ميكرومتر جهاز تصفية (Nalgene). ملاحظة : لا RNA الماصة مباشر?...

<ol>
	<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical+"footprinting":+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein.">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li><li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic+acid+catalyzed+cleavage+of+RNA+and+DNA+oligonucleotides:+similar+reactivity+toward+single-+and+double-stranded+forms.">Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms.</a> Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).</li><li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+higher+order+folding+of+a+catalytic+RNA+molecule.">Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule.</a> Science. 251, 401-407 (1991).</li><li>Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+folding+at+millisecond+intervals+by+synchrotron+hydroxyl+radical+footprinting.">RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting.</a> Science. 279, 1940-1943 (1998).</li><li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical+footprinting:+a+high-resolution+method+for+mapping+protein-DNA+contacts.">Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts.</a> Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementing+global+measures+of+RNA+folding+with+local+reports+of+backbone+solvent+accessibility+by+time+resolved+hydroxyl+radical+footprinting.">Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting.</a> Methods. 49, 142-147 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+endoribonuclease+activity+of+the+Tetrahymena+ribozyme:+enhanced+cleavage+of+certain+oligonucleotide+substrates+that+form+mismatched+ribozyme-substrate+complexes.">Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes.</a> Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).</li><li>Knapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+approaches+to+probing+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure.">Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).</li><li>Slatko, B. E., Albright, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denaturing+gel+electrophoresis+for+sequencing.">Denaturing gel electrophoresis for sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAFA:+semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> RNA. 11, 344-354 (2005).</li><li>Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+*OH+radical+footprinting+data+using+SAFA.">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li><li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme.">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li><li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain:+principles+of+RNA+packing.">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li><li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+nucleic+acids+footprinting:+thermodynamic+and+kinetic+approaches.">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li><li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+RNA+compaction:+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations.">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li><li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNase+footprint+titration:+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions.">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li><li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure.">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly.">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly.">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li><li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters.">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li></ol>

footprinting الهيدروكسيل هو أداة قيمة لتقييم المذيب مساحة يمكن الوصول إليها من الأحماض النووية. يمكن أن يتبع تشكيل النوعي والكمي لهيكل التعليم العالي 14 بوصفها وظيفة من المعلمات مثل نوع وتركيز أيون ، ودرجة الحموضة ، درجة الحرارة ، والبروتينات ملزمة أو قابلة للطي الع?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Name</th>
			<th>Company</th>
			<th>Cat#</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate
			(Caution! Toxic)	 	
			</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4945-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9915G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-7876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1543-500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (30%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>349887</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring equilibrium changes in rna structure by 'peroxidative' and 'oxidative' hydroxyl radical footprinting

جزيئات الحمض النووي الريبي تلعب دورا أساسيا في علم الأحياء. بالإضافة إلى نقل المعلومات الوراثية ، يمكن أن الحمض النووي الريبي أضعاف في هياكل التعليم العالي دورا فريدا الوفاء بيولوجية محددة على النحو الموثق ، منظم أو المحفز. معلومات حول تكوين الاتصال العالي ضروري لفهم وظيفة من جزيئات الحمض النووي الريبي. جذور الهيدروكسيل (OH •) هي تحقيقات فريد هيكل الأحماض النووية بسبب التفاعلات عالية وحجم صغير. 1 عندما تستخدم على النحو التحقيق footprinting ، جذور الهيدروكسيل خريطة سطح المذيب يمكن الوصول إليها في العمود الفقري phosphodiester من الحمض النووي الريبي (1) و2 مع غرامة مثل القرار النوكليوتيدات واحد. ويمكن استخدام footprinting الهيدروكسيل لتحديد النيوكليوتيدات داخل سطح التماس بين الجزيئات ، مثل الحمض النووي في البروتين (1) والجيش الملكي النيبالي المجمعات البروتين. ويمكن تحديد التوازن 3 و 4 التحولات الحركية من خلال إجراء footprinting الهيدروكسيل كدالة لsolutiعلى المتغير أو الوقت ، على التوالي. ومن السمات الرئيسية لfootprinting هو أن تقتصر على التعرض لجنة التحقيق (على سبيل المثال ، &quot;واحد من الزلزال حركية&#39;) في نتائج موحدة لأخذ العينات من كل من البوليمر النوكليوتيدات 5 في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نستخدم المجال P4 - P6 من ribozyme رباعية لتوضيح RNA إعداد وتصميم عينة من الأيسوثرم (II) بوساطة المغنيسيوم للطي. نحن تصف استخدام معروفة الهيدروكسيل بروتوكول footprinting جذرية تتطلب H 2 O 2 (نحن نسمي هذا &quot;peroxidative&#39; البروتوكول) ، وقيمة ، ولكن ليس معروفا على نطاق واسع ، وهذا البديل يا المنحل يستخدم بشكل طبيعي 2 (نحن نسمي هذا &quot;لل التأكسدي &#39;البروتوكول). ويقدم لمحة عامة عن تقليص البيانات وتحويلها وإجراءات التحليل.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting at JoVE.com

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

هذا البروتوكول توضح كيفية قياس المغنيسيوم (II) التي تعتمد على تشكيل بنية الحمض النووي الريبي العالي من قبل اثنين من أساليب footprinting الهيدروكسيل.

التغييرات في هيكل رصد التوازن الحمض النووي الريبي ل &#39;Peroxidative&#39; و &#39;مؤكسد&#39; Footprinting الهيدروكسيل

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...