Name: in vivo dual substrate bioluminescent imaging
Uploaded: 2011-10-11T13:00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging at JoVE.com

WPS была выполнена при частичной поддержке грантов от Национального института здоровья (CA129359), Сьюзен Г. Комен для Лечения Foundation (BCTR0706967), Министерство обороны (BC084561), а Сейдман онкологический центр, в то время MKW был поддержан стипендии от Американского онкологического общества (PF-09-120-01). Дополнительная поддержка для этой работы была предоставлена ​​корпуса Центра Imaging Research, дело Всесторонний Онкологический центр (P30 CA43703), и кистозный фиброз центра (P30 DK027651).

<ol>
	<li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow:+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease.">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li><li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells.">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li><li>Wendt, M., Schiemann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+the+focal+adhesion+complex+prevents+oncogenic+TGF-beta+signaling+and+metastasis.">Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis.</a> Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).</li><li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis.">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li><li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis.">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li><li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages.">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li><li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors.">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells.">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li><li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression.">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li><li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Light,+No+Lysis.">Bright Light, No Lysis.</a> Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells. , (2005).</li><li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents.">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Абсолютная власть биолюминесцентных методов визуализации заключается в их способности к количественному росту опухоли и метастазов в сложных продольных исследований, которые здесь связаны с использованием агрессивных 4T1 клеток рака молочной железы. Поскольку эти процедуры рассчитывать на стабильную интеграцию как репортер люциферазы конструкции, эти методы могут быть легко адаптированы и переведены на другие клеточные линии рака различной опухоли задержки и метастатического потенциала. Как и результаты, показанные здесь, расчета конкретных RLRs в медленно развивающихся первичных опухолей и их возможного метастазы позволяет в режиме реального времени пространственно-временные определения конкретных сигнальных событий, что происходить в течение метастатического прогрессирования опухоли независимо от их продолжительности задержки. При выявлении конкретных нормативных промоутер событий, важно акцизного как первичной опухоли и ее метастазов для выполнения стандартных иммуногистохимических и дифференциациял анализ экспрессии генов для проверки Аналогичное положение эндогенного гена и / или белка. С технической точки зрения, основной проблемой двойного биолюминесцентного анализа заключается в относительно короткий период Renilla люциферазы сигналов. Таким образом, эта техника визуализации требует значительных оптимизации процедуры инъекции хвостовую вену, а также непосредственные изображения индивидуально вводили животным, процесс, который занимает много времени и несколько неэффективной по отношению к люциферазы светлячка изображений. Недавно Promega представил &quot;Viviren&quot;, который представляет собой вторую подложку люциферазы поколения, чьи сайты окисления их этерификации, пока эта запись молекулы прибыли в клетки, после чего молекула быстро деэтерифицируют. В совокупности этот роман подложки эффективно снижает авто-люминесценции и неспецифические изменения и / или деградация связана с Renilla-индуцированной люминесценции авто-12. При этом, эта новая renillлюциферазы подложке обеспечивает более яркие люминесцентные сигналы, однако чрезмерные расходы, связанные с приобретением и использованием &quot;Viviren&quot; предоставили сравнительно мало исследований, необходимых для оценки общей полезности этого субстрата в двойном биолюминесцентного анализа. Наконец, чувствительность любого биолюминесцентного анализа является решающей степени зависит от камеры CCD оперантного в приобретении отдельных световых единиц. Действительно, как эти технологии улучшаются, мы предвидим в будущем, где наша способность визуализировать сложные свет-опосредованной биолюминесцентного реакции могут происходить эффективно свободное перемещение животных 13.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vector </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> Glomax Mult-idection системы </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> ИВИС серии 200 </td><td> Суппорт Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Двойная система анализа люциферазы репортера </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject coelenterazine-ч </td><td> Суппорт Life Sciences </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-Luciferin K-Соль </td><td> Суппорт Life Sciences </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual substrate bioluminescent imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging at JoVE.com

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Здесь мы опишем методы построения, визуализации и количественной оценки биолюминесцентного реакции как светлячков и Renilla люциферазы ферментов выражена в метастатических клеток рака молочной железы в процессе их роста и метастазирования<em&gt; В естественных условиях</em&gt;.

В естественных условиях двойного основания Bioluminescent изображений

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Мышиной модели Биолюминесцентный опухоли Печеночная

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Два режима изображения кожных оксигенации тканей и сосудистой функции

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Внутричерепное имплантация с последующим 3D В Vivo Биолюминесцентный изображений из мышиной глиомы

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Стереотаксическая имплантация и внутричерепных<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Bioluminescent Визуализация опухолевых ксенотрансплантатов в системе мышиной модели глиобластомы

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

В естественных изображений опухолевого ангиогенеза с помощью флуоресцентной конфокальной видеомикроскопии

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Биолюминесцентный Ортотопическая Модель прогрессировании рака поджелудочной железы

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

В естественных условиях 19 F МРТ для отслеживания сотовых

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Имитация поджелудочной Нейропластичность:<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Dual-нейрон Пластичность Анализ

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Последовательный<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация остеогенные стволовых / клеток-предшественников во время разрушения Ремонт

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Химиотерапия индуцированных Сосудистая токсичность - в режиме реального времени<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображений судна обесценение

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...