Name: specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, 0079874 #), תוכנית טכנולוגיה מתקדמת טקסס (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), טקסס A &amp; M Research Foundation, הפקולטה למדעי המחשב והנדסה באוניברסיטת טקסס A &amp; M האוניברסיטה, 3Scan. ברצוננו להודות ברנרד Mesa (Micro Star Technologies) להתייעצות ותמיכה טכנית עבור מכשור KESM. החלקים העיקריים של התכנון והיישום של KESM נעשה על ידי ברוס ח מקורמיק, שנפטר בשנת 2007.

1. הכנת הדגימה: Golgi-Cox <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מקרוב אחרי פרוטוקול של Mayerich et al. 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר C57BL/6J הוא מורדם באמצעות הרדמה עמוקה נשימתית isoflurane ו ערופה אז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא הסיר והניח לתוך פתרון Golgi-קוקס קיבעון (1% אשלגן כרומטי, dichromate אשלגן 1%, ו כלוריד כספיתי 1% במים deionized). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא נשאר פתרון Golgi-קוקס בחושך, בטמפרטורת החדר, במשך 10 עד 16 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוחות הם ושטף במים deionized לילה בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח ושטף הוא שקוע בפתרון 5% אמוניום הידרוקסיד במים deionized במשך 7 עד 10 ימים בחושך בטמפרטורת החדר. הפעם היה הכנה ממושכת כדי להבטיח חדירה של המוח כולו, כך נמהרת שחור היה סיכוי לחלוטין צורה ברקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא שטפה שוב בטמפרטורת החדר במים deionized במשך 4 שעות ו t50% ו 70% במקרר (4 ° C), ו - 85%, 95% (3 שינויים), ו -100% (4-5 שינויים) בטמפרטורת החדר: מיובש דרך סדרה מדורגת של אתיל אלכוהול תרנגולת. המוח הוא נשאר פתרון עבור כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח מיובש הוא לשים אז אצטון (3-4 שינויים, כל יום אחד), ואחריו תערובת araldite-אצטון עם יחס araldite ל-אצטון של 01:02, 01:01, 02:01, ולבסוף araldite 100% (3 שינויים, כל פעם במשך הלילה), במקרר (4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, במוח המטופל מוטבע araldite 100% מחומם ל 60 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים (ראה פרוטוקול הטבעה של אבוט Sotelo 2). אם דגימות המוטבעים LR הלבן ואז דגימות מועברים מפתרון אתנול האחרון 100% באמצעות שלושה שינויים של פתרון הלבן LR, כי הם כל הזמן במקרר למשך הלילה, שהוא הליך סטנדרטי לקראת פילמור. שלושה שינויים נעשים כדי להבטיח חדירה מלאה. הדגימה היא לאתרנגולת הועבר טרי LR הלבן כי הוא polymerized בכלי סגור ב 60 ° C למשך 24 שעות, המהווה את הסכום הנדרש של זמן וטמפרטורה של פילמור תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איור. 1 מראה המוח Golgi-קוקס מוכתם מוטבע Araldite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלוק הדגימה נרפא מותקן אז על טבעת המתכת הדגימה באמצעות אפוקסי, והצדדים של גוש גזוז לפי הצורך (ראה איור. 2). </li></ol> 2. הכנת הדגימה: Nissl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר הוא מורדם באמצעות עמוק קטמין ו xylazine (1.7 מ&quot;ג קטמין / 0.26 xylazine מ&quot;ג לכל 20 גרם משקל גוף) intraperitoneally מוזרק ואז perfused transcardially באמצעות 50 מ&quot;ל של בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (pH 7.4), ואחריו 250 מ&quot;ל של החדר טמפרטורה של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין (pH 7.4). ולבסוף עם 3.0 סמ&quot;ק של דיו הודו חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף גוף שלמות עם מלח ו מקבע יש צורך לנקות את הדם ממערכת הלב וכלי הדם כדי לתקן את טי<html> ssues. זלוף בדיו הודו יש צורך לחלוטין למלא את כלי הדם של מערכת הלב וכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח וכתוצאה מכך הוא מיובש אז דרך סדרה של ציון אתיל אלכוהול (25% -100%) ו מוטבעים אז פלסטיק araldite בעקבות פרוטוקול של 1.8-1.9 לעיל. אם LR לבן הוא המדיום הטבעה אז פרוטוקול ב 1.10 לעיל אחריו. </li></ol> 4. הכנת הדגימה: מינים גנרי, איברים גנריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המקרה גנריות, קיבוע ניתן לעשות גם עם paraformaldehyde 10% שנאגרו נייטרלי% פורמלין או 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אמצעי אחסון רקמה קטן, דיפוזיה במקום זלוף מומלץ קיבעון ו מכתים. במקרה של אורגניזמים או איברים קטנים, מכתים גם ניתן לעשות בתהליך התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול הטבעה זהה לעיל, אם כי פעמים חדירה הפתרון יכול להיות מופחת עבור איברים או אורגניזמים קטנים בהרבה במוח העכבר כולו. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. KESM ההתקנה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המשאבה, בתורו על הבמה, להדליק מצלמה, להדליק את הפנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים סכין אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת טבעת הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימה מדוד מימד ליצור קובץ תצורה עבור היישום KESM שלב Controller2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל KESM שלב Controller2 ו לאתחל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין תחתון / אובייקטיבי, להפעיל את המשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס אובייקטיבי המצלמה, על ידי סיבוב ידית התמקדות הרכבת אופטיים התאמת השדה של המצלמה להציג יחסית קצה הסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על [עבור] ליזום הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה תאנים. 3-8. ראה 9, 7 לפרטים טכניים. </li></ol> 6. עיבוד תמונה והכנת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את סטאק KESM הפעלה מעבד לתוך תיקיית הנתונים תחת התיקיה את קובץ הקונפיגורציה (00,000, 00,001 וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מעבד סטאק KESM להסיר חפץ תאורה לנרמל את עוצמת רקע כלתמונות. חזור על הפעולה עבור כל תיקיות המשנה נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו אריחים multiscale מהנתונים להגדיר ולהעלות והקים את הקבצים לשרת אטלס KESM המוח האינטרנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה איור. 9. </li></ol> 7. נתונים להדמיה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה באמצעות אטלס המוח KESM. עבור <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> ובחר אטלס המתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט כמו ב-Google Maps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום פנימה והחוצה כמו ב-Google Maps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבור אל עומק אחר, בחר כמה עמוק ללכת בכל שלב מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן לחץ על או [+] או [-] כדי להגדיל או להקטין עומק z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מספר כיסוי באמצעות התפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המרווח כיסוי באמצעות התפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה איור. 11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה באמצעות MeVisLab. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקת MeVisLab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פרוייקט חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחודש הבא, מודולים חדשים ניתן ליצור על ידי tyפינג בשם מודול בתיבה פקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [Compose3Dfrom2DFiles], וללכת אל התיקיה הרצויה. הזן מחרוזת הקובץ לחץ [GetFileList]. ודא את התמונות הנבחרות יכול להתאים בזיכרון. לחץ [Create3D] כדי ליצור נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [SetWorldMatrix], וכן להגדיר את &quot;סולם&quot; תחת &quot;הופך היסודי&quot; x, y, z לגודל voxel המתאים (0.6, 0.7, 1.0 למטרה 0.45NA 10X). קישור [Compose3Dfrom2DFiles] ל [SetWorldMatrix]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט מטריקס הופכת תחת &quot;הרכב מטריקס&quot; ל &quot;התעלם&quot;, &quot;התעלם&quot;, &quot;קדימה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [Arithmetic1] וקבע את &quot;פונקציה&quot; על &quot;הפוך (Max-IMG)&quot;. קישור [SetWorldMatrix] ל [Arithmetic1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודול [View3D] וחבר [Arithmetic1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב View3D, בעוד הלחצן הימני של העכבר לחוץ, הזז את העכבר מסביב כדי להתאים את הסף. אתה יכול לחתוך אזורים, נטייה לשנות (להזיז את העכבר בזמן לחצן העכבר השמאלי לחוץ), לשנות את התאורה (renderin נפחגרם או MIP), להפוך on / off רקע, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה איור. 10. </li></ol></li></ol> 8. נציג תוצאות: כאן, אנו מציגים המוח כולו נתונים ופרטים. תאנים. 12-15 להראות המוח כולו הודו דיו, Golgi, ונתונים Nissl סטים 1, 4, 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" /> באיור 1. במוח העכבר קבוע, מוכתם, ומוטבעים <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" /> באיור 2. Embedded המוח הדגימה עכבר רכוב על טבעת את הדגימה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" /> באיור 3. סכין The Edge סריקת מיקרוסקופ (KESM). תמונה של KESM מוצג עם הרכיבים העיקריים שלה מסומן: (1) במהירות גבוהה קו סריקה המצלמה, (2) המטרה מיקרוסקופ, (3) הרכבה יהלום סכין collimator אור, (4) speטנק cimen (הדמיה טבילה במים), (5) בשלושה צירים דיוק אוויר נושאי הבמה, (6) לבן אור הפנס מיקרוסקופ, (7) משאבת מים (מאחור) להסרת רקמה מחולק, (8) PC שרת לבקרת הבמה רכישת התמונה, (9) בסיס גרניט (10) גשר גרניט. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" /> איור 4. עקרונות הדמיה של KESM. המנהל המבצע של KESM מודגם. המטרה ואת סכין מוחזק במקום, בעוד הדגימה מודבקת על הבמה נע מיצוב (חץ עם קו מוצק) ברזולוציה של 20 ננומטר ומהירות הנסיעה של 1-5, ומקבל והשתפשפה סכין יהלום (5 מ&quot;מ רחב עבור המטרה 10X), יצירת קטע דק זורם על הסכין (חץ עם קו מוצק). קו סריקה הדמיה נעשה ליד קצה מאוד של הסכין. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" /> איור 5. המצלמה KESM בקרות התמקדות אובייקטיבי. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" /> איור 6. הרכבה KESM סכין שולטת. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" /> איור 7. ראשוני התמקדות דרך נמל תצפית. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" /> איור 8. Controller KESM שלב 2 בקשה (צילום מסך). <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" /> איור 9. מעבד KESM מחסנית היישומים (צילום מסך). <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" /> איור 10. היישום MeVisLab (צילום מסך). <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" /><br/&gt; איור 11 KESM המוח אטלס:. ממשק אינטרנט (צילום מסך). <img alt="איור 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" /> איור 12. KESM המוח כולו נתונים הודו דיו. חזותיים נפח ערימות KESM הנתונים מוצגים עבור ערכת נתונים וסקולרית. (א) מקרוב של הנתונים של כלי הדם. רוחב 100 ~ אממ. (BD) שלוש תצוגות סטנדרטיות של המוח כולו עכבר vasculature (subsampled מתוך נתונים ברזולוציה גבוהה). רוחב ~ 10mm. <img alt="איור 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" /> איור 13. המוח כולו KESM עכבר נתונים Golgi. <img alt="איור 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" /> איור 14. KESM Golgi פרטים נתונים. <img alt="איור 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" /> איור 15. KESM המוח כולו נתונים Nissl. (א) תקריב של Nנתונים issl. אממ ~ 300 3. (BD) שלוש תצוגות סטנדרטיות של המוח נתונים שלם עכבר Nissl (subsampled מתוך נתונים ברזולוציה גבוהה). חתך הראו עבור תצוגה ברורה של מבנים פנימיים.

<ol>
	<li>Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+whole+small+animal+brains+with+the+knife-edge+scanning+microscope.">High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).</li><li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices.">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging,+analysis,+and+integration+of+mouse+brain+networks.">Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).</li><li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure:+Neurons+and+vasculatures.">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy:+High-throughput+imaging+and+analysis+of+massive+volumes+of+biological+microstructures.">Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures.</a> High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope.">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM.">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li><li>McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Brain+Tissue+Scanner.">Development of the Brain Tissue Scanner.</a> Technical Report. , (2002).</li><li>Sporns, O., Tononi, G., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+connectome:+A+structural+description+of+the+human+brain.">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li></ol>

טוד האפמן הוא עם 3Scan, חברה מסחרית המייצרת ומשווקת טכנולוגיה KESM (פטנט בארה&quot;ב # 6744572).

KESM מאפשרת סקר submicrometer ברמה של כמויות גדולות של דגימות ביולוגיות (~ 1 ס&quot;מ 3). סוג זה של נפח הוא מספיק כדי להכיל את כל האיברים בעלי חיים קטנים, כמו המוח, הריאות, הלב, הכליות, ועוד תמונות סרוקות מאיברים אלה יכולים לספק מידע כמותי חסר תקדים על הארגון המבני של איברים אלה, ולאפשר מודלים חישוביים של פונקציונליים שונים היבטים של איברים אלה, כולל דינמיקה מעגל רשת, תכונות חשמליות, נוזלים וזרימה הדינמיקה אוויר, ואת הדינמיקה שרירים. הכנת הדגימה פרוטוקול שלאחר ניתוח פרוטוקול מפורט במאמר זה צפויים לעזור קבוצות מחקר מחוץ יש גישה קלה יותר KESM לבין הנתונים המתקבלים. הפרוטוקול מבצע KESM יעזור אלה חוקרים חיצוניים כדי להעריך את היתרונות והמגבלות של שיטת הדמיה ייחודית זו.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy

התקדמות ניכרת תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, שיטות מיקרוסקופיה 3D אפשרו רכישת כמויות גדולות של נתונים neuroanatomical ברזולוציה submicrometer. אחד הכלים הראשון מסוגו, בהפקת המוח כולו בקנה מידה הנתונים הוא מיקרוסקופ כסכין סריקה (KESM) 7, 5, 9, שפותחה ואירוח במעבדה של המחברים. KESM שימש סעיף ו כל דמות העכבר מוחות ברזולוציה submicrometer, חושף את הפרטים המורכבים של רשתות נוירונים (Golgi) 1, 4, 8, רשתות כלי דם (דיו הודו) 1, 4, גוף התא הפצה (Nissl) 3 . השימוש KESM אינו מוגבל העכבר ולא את המוח. יש לנו הדמיה בהצלחה את המוח תמנון 6, ריאות העכבר במוח חולדה. כרגע אנחנו עובדים על כל עוברי דג הזברה. נתונים כאלה יכול מאוד לתרום connectomics מחקר 10; אל microcirculation ומחקר hemodynamic וכן מחקר stereology ידי proviדינג מדויק הקרקע האמת. במאמר זה נתאר את הצינור, כולל הכנת הדגימה (תיקון, צביעה, והטבעה) תצורה KESM וההתקנה, חתך הדמיה עם KESM, עיבוד תמונה, הכנת נתונים, נתונים להדמיה וניתוח. הדגש יהיה על הכנת הדגימה ויזואליזציה / ניתוח של נתונים שהתקבלו KESM. אנו מצפים פרוטוקול מפורט שהוצג במאמר זה כדי לעזור להרחיב את הגישה KESM ולהגדיל את ניצול שלה.

Watch this Scientific Journal Video about Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy at JoVE.com

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

תהליך מלא של הכנת הדגימה המוח הדמיה חתך סדרתי באמצעות מיקרוסקופ כסכין סריקה, עד ראיה וניתוח של נתונים מתואר. טכניקה זו משמשת כיום לרכוש במוח העכבר נתונים, אך הוא החלים על איברים אחרים, מינים אחרים.

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid Ãƒâ€šÃ‚ÂµCT-FMT imaging and image analysis

הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...