Name: specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
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Questo progetto è stato finanziato dal NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), la tecnologia Texas Advanced Program (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A &amp; M Fondazione per la Ricerca, Dipartimento di Informatica e Ingegneria presso la Texas A &amp; M University, e 3Scan. Vorremmo ringraziare Bernard Mesa (Micro Technologies stella) per consulenza tecnica e supporto per la strumentazione KESM. Parti più importanti della progettazione e realizzazione del KESM è stato fatto da Bruce H. McCormick, morto nel 2007.

1. Preparazione del campione: Golgi-Cox <ol><li> Questo protocollo segue da vicino il protocollo di Mayerich et al. 7. </li><li> Il mouse C57BL/6J è profondamente anestetizzato in anestesia isoflurano inalanti e poi decapitato. </li><li> Il cervello è rimosso e collocato in una Golgi-Cox soluzione di fissaggio (1% cromato di potassio, bicromato di potassio 1% e 1% di cloruro di mercurio in acqua deionizzata). </li><li> Il cervello è lasciato nel Golgi-Cox soluzione al buio, a temperatura ambiente, da 10 a 16 settimane. </li><li> I cervelli vengono risciacquati in acqua deionizzata una notte al buio. </li><li> Il cervello risciacquata è immerso in una soluzione di idrossido di ammonio al 5% in acqua deionizzata per 7 a 10 giorni al buio a temperatura ambiente. Questa volta una lunga preparazione è stato quello di garantire l&#39;infiltrazione di tutto il cervello, in modo che il precipitato nero avuto la possibilità di formare completamente nel tessuto. </li><li> Il cervello è nuovamente sciacquati con acqua deionizzata a temperatura ambiente per 4 ore e tgallina disidratati attraverso una serie graduata di alcool etilico: 50% e il 70% in frigorifero (4 ° C), e 85%, 95% (3 modifiche), e del 100% (da 4 a 5 cambi) a temperatura ambiente. Il cervello è lasciato in ogni soluzione per 24 ore. </li><li> Il cervello disidratato viene poi messo in acetone (3 a 4 cambiamenti, ognuno per un giorno), seguita da un araldite-acetone con Araldite-to-acetone rapporto di 1:2, 1:1, 2:1, e infine in 100 Araldite% (3 modifiche, di volta in volta durante la notte), in frigorifero (4 ° C). </li><li> Infine, il cervello trattata è incorporato nel 100% Araldite e riscaldata a 60 ° C per 3 giorni (embedding protocollo cfr. in Abbott e Sotelo 2). Se i campioni sono incorporati in LR bianco poi gli esemplari sono trasferiti dal l&#39;ultima soluzione di etanolo al 100% attraverso tre cambi di soluzione LR bianchi che vengono ogni conservato in frigorifero per una notte, che è una procedura standard prima di polimerizzazione. Tre cambiamenti sono fatto per garantire l&#39;infiltrazione completa. Il campione è tgallina trasferito al fresco LR Bianca che è polimerizzato in un contenitore chiuso a 60 ° C per 24 ore, che è la quantità di tempo e temperatura corretta per la polimerizzazione. </li><li> Fig. 1 mostra una Golgi-Cox cervello colorato incorporato in Araldite. </li><li> Il campione e curata è poi montato sul ring campione di metallo con resina epossidica, e ai lati del blocco tagliato, se necessario (vedi fig. 2). </li></ol> 2. Preparazione del campione: Nissl <ol><li> Il mouse è profondamente anestetizzati con ketamina e xilazina (1,7 mg di ketamina / xylazina 0,26 mg per 20 grammi di peso corporeo) iniettato per via intraperitoneale e poi perfusi transcardially con 50 ml della temperatura ambiente PBS (pH 7,4), seguita da 250 ml di stanza temperatura 10% formalina tamponata neutra (pH 7,4). e, infine, con 3,0 cc di puro inchiostro di china. </li><li> Perfusione del corpo intero con soluzione salina e fissativo è necessaria per cancellare il sangue dal sistema cardiovascolare e per fissare il ti<html> UESTIONI. Perfusione con inchiostro di china è necessario riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare. </li><li> Il cervello risultante viene poi disidratati attraverso una serie di graduata alcoli etilico (25% -100%) e poi incorporato in plastica araldite seguendo il protocollo di 1,8-1,9 sopra. Se LR bianco è il mezzo di inclusione poi il protocollo di 1,10 come indicato precedentemente. </li></ol> 4. Preparazione del campione: specie generico, organi generico <ol><li> Per il caso generico, la fissazione può essere fatta sia con il 10% neutra paraformaldeide tamponata% formalina o 4. </li><li> Per i volumi di tessuto di piccole, la diffusione invece di perfusione è consigliato per la fissazione e colorazione. Nel caso di piccoli organismi o organi, la colorazione può anche essere fatta durante il processo di disidratazione. </li><li> Il protocollo embedding è la stessa di sopra, anche se i tempi per l&#39;infiltrazione soluzione può essere ridotto per organi o organismi che sono molto più piccoli di cervello di topo intero. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. KESM setup e di imaging <ol><li> Spegnere la pompa, sono avvicendati sul palco, accendere fotocamera, accendere illuminatore. </li><li> Sollevare coltello e obiettivo. </li><li> Installare l&#39;anello campione. </li><li> Misura dimensione del campione e creare un file di configurazione per l&#39;applicazione Fase KESM Controller2. </li><li> Inizio KESM fase Controller2 e inizializzare palco. </li><li> Inferiore coltello / obiettivo, accendere la pompa. </li><li> Messa a fuoco obiettivi e macchina fotografica, ruotando la manopola di messa a fuoco sul treno ottico e regolazione campo visivo della telecamera di vista rispetto al bordo coltello. </li><li> Premere sul [Vai] per avviare l&#39;imaging. </li><li> Vedi fig. 3-8. Vedi 9, 7 per i dettagli tecnici. </li></ol> 6. Elaborazione delle immagini e la preparazione dei dati <ol><li> Copiare lo stack eseguibile KESM processore nella cartella dati nella cartella file di configurazione (00000, 00001, ecc.) </li><li> Eseguire il processore Stack KESM per rimuovere artefatti di illuminazione e normalizzare l&#39;intensità di fondo in tutte lele immagini. Ripetere l&#39;operazione per tutte le sottocartelle dei dati. </li><li> Preparare piastrelle multiscala dal set di dati e caricare e configurare i file nel server web cervello KESM Atlas. </li><li> Vedi fig. 9. </li></ol> 7. Dati di visualizzazione e analisi <ol><li> Visualizzazione utilizzando l&#39;Atlante Cervello KESM. Vai a <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> e selezionare l&#39;atlante appropriato. <ol><li> Come navigare nelle mappe di Google. </li><li> Zoom avanti e indietro come nelle mappe di Google. </li><li> Per passare a una diversa profondità, selezionare la profondità di andare ad ogni passo dal menu a discesa, quindi fare clic su entrambi [+] o [-] per aumentare o diminuire la profondità z. </li><li> Regolare il numero di sovrapposizione utilizzando il menu a discesa. </li><li> Regolare l&#39;intervallo di sovrapposizione utilizzando il menu a discesa. </li><li> Vedi fig. 11. </li></ol></li><li> Visualizzazione utilizzando MeVisLab. <ol><li> Lancio MeVisLab. </li><li> Creare un nuovo progetto. </li><li> In seguito, nuovi moduli possono essere la creazione di Typing nel nome del modulo nella casella dei comandi. </li><li> Creare modulo [Compose3Dfrom2DFiles], e andare alla cartella desiderata. Inserire la stringa di file e fare clic in [GetFileList]. Assicurarsi che le immagini selezionate può andare bene nella memoria. Fare clic su [Create3D] per creare volume. </li><li> Creare modulo [SetWorldMatrix] e impostare la &quot;Scala&quot; sotto &quot;Elementare Transforms&quot; x, y, z per la dimensione appropriata voxel (0,6, 0,7, 1,0 per un obiettivo 10X 0.45NA). Link [Compose3Dfrom2DFiles] a [SetWorldMatrix]. </li><li> Impostare Matrix e trasformate in &quot;Composizione Matrix&quot; a &quot;Ignora&quot;, &quot;Ignora&quot;, &quot;Avanti&quot;. </li><li> Creare modulo [Arithmetic1] e impostare la &quot;funzione&quot; a &quot;Inversione (Max-Img)&quot;. Link [SetWorldMatrix] a [Arithmetic1]. </li><li> Creare modulo [View3D] e collegare [Arithmetic1]. </li><li> In View3D, mentre il pulsante destro del mouse è premuto, spostate il mouse per regolare la soglia. È possibile ritagliare le regioni, orientamento cambiamento (muovere il mouse mentre il tasto sinistro del mouse è premuto), l&#39;illuminazione cambia (renderin il volumego MIP), accendere / spegnere sfondo, ecc </li><li> Vedi fig. 10. </li></ol></li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Qui vi presentiamo tutto il cervello di dati e dettagli. Fichi. 12-15 intero spettacolo-cervello India Ink, Golgi, e Nissl set di dati 1, 4, 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" /> Figura 1. Cervello di topo fisso, macchiato, ed embedded <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" /> Figura 2. Embedded campione cervello di topo montate sul ring campione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" /> Figura 3. Knife Edge Microscopio Scansione (KESM). Una foto del KESM è mostrato con i suoi principali componenti segnato: (1) linea ad alta velocità di scansione fotocamera, (2) obiettivo microscopio, (3) assemblaggio coltello di diamante e collimatore di luce, (4) specimen serbatoio (per l&#39;imaging di immersione in acqua), (5) a tre assi di precisione aria-cuscinetto stadio, (6) a luce bianca illuminatore microscopio, (7) pompa dell&#39;acqua (nella parte posteriore) per il prelievo di tessuti sezionati, (8) PC server per il controllo del palco e acquisizione delle immagini (9), base in granito, e (10) ponte di granito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" /> Figura 4. Imaging principi della KESM. Il principio di funzionamento di KESM è illustrata. L&#39;obiettivo e il coltello è tenuto sul posto, mentre il campione apposto sul palco si muove il posizionamento (freccia con linea continua) alla risoluzione di 20 nm e velocità di traslazione di 1-5, ed ottiene raschiato contro il coltello di diamante (5 mm di larghezza per l&#39;obiettivo 10X), generando una sezione sottile che scorre sopra il coltello (freccia con linea continua). Line-scansione di immagini è fatto vicino la punta del coltello. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" /> Figura 5. KESM fotocamera e obiettivo controlli messa a fuoco. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" /> Figura 6. Assemblaggio coltello KESM e controlli. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" /> Figura 7. Iniziali di messa a fuoco attraverso la porta di osservazione. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" /> Figura 8. Controller KESM Fase 2 applicazione (screenshot). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" /> Figura 9. Stack di applicazione KESM processore (screenshot). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" /> Figura 10. MeVisLab applicazione (screenshot). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" /><br/&gt; Figura 11 KESM Cervello Atlas:. Interfaccia Web (screenshot). <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" /> Figura 12. KESM tutto il cervello dati inchiostro di china. Visualizzazione volume di dati KESM pile sono indicati per il set di dati vascolare. (A) primo piano i dati vascolare. Larghezza ~ 100 um. (Bd) tre viste standard del cervello intero sistema vascolare del mouse (sottocampionate di dati ad alta risoluzione). Larghezza ~ 10mm. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" /> Figura 13. KESM intero-cervello di topo dati Golgi. <img alt="Figura 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" /> Figura 14. KESM Golgi dettagli dei dati. <img alt="Figura 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" /> Figura 15. KESM dati Nissl tutto il cervello. (A) primo piano del Ndati ISSL. ~ 300 um 3. (Bd) tre viste standard di tutti i dati del mouse cervello Nissl (sottocampionate di dati ad alta risoluzione). Sezione mostrato per una chiara visione delle strutture interne.

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	<li>Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+whole+small+animal+brains+with+the+knife-edge+scanning+microscope.">High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).</li><li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices.">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging,+analysis,+and+integration+of+mouse+brain+networks.">Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).</li><li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure:+Neurons+and+vasculatures.">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy:+High-throughput+imaging+and+analysis+of+massive+volumes+of+biological+microstructures.">Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures.</a> High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope.">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM.">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li><li>McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Brain+Tissue+Scanner.">Development of the Brain Tissue Scanner.</a> Technical Report. , (2002).</li><li>Sporns, O., Tononi, G., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+connectome:+A+structural+description+of+the+human+brain.">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li></ol>

Todd Huffman è con 3Scan, una società commerciale che produce e commercializza la tecnologia KESM (brevetto US # 6744572).

Il KESM consente una submicrometer livello sondaggio di grandi volumi di campione biologico (~ 1 cm 3). Questo tipo di volume è sufficiente a contenere interi organi per piccoli animali, come cervello, polmoni, cuori, reni, ecc acquisite le immagini da tali organi senza precedenti in grado di fornire informazioni quantitative circa l&#39;organizzazione strutturale di questi organi, e consentire la modellazione computazionale funzionale di varie aspetti di questi organi, compreso le dinamiche di circuito e di rete, proprietà elettriche, dei fluidi e la dinamica del flusso d&#39;aria, e la dinamica muscolare. Il protocollo di preparazione dei campioni e post-analisi protocollo dettagliato in questo articolo sono attesi per aiutare i gruppi di ricerca esterni per avere un più facile accesso al KESM nonché i dati risultanti. Il protocollo operazione KESM aiuterà questi ricercatori esterni per apprezzare i vantaggi ei limiti di questa modalità di imaging unico.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy

Importanti progressi nella high-throughput ad alta risoluzione, tecniche di microscopia 3D hanno permesso l&#39;acquisizione di grandi volumi di dati neuroanatomici a risoluzione submicrometer. Uno dei primi strumenti quali la produzione di tutto il cervello scala dei dati è il Knife-Edge microscopio a scansione (KESM) 7, 5, 9, sviluppato e ospitato nel laboratorio degli autori &#39;. KESM è stato utilizzato per sezione e cervelli del mouse intera immagine a una risoluzione submicrometer, rivelando gli intricati dettagli delle reti neuronali (Golgi) 1, 4, 8, reti vascolari (inchiostro di china) 1, 4, e il corpo di distribuzione delle cellule (Nissl) 3 . L&#39;uso di KESM non è limitato al mouse né il cervello. Abbiamo ripreso con successo il cervello polpo 6, polmone del mouse e cervello di ratto. Attualmente stiamo lavorando su tutto embrioni di pesce zebra. Dati come questi possono contribuire ampiamente a connectomics ricerca 10; per la microcircolazione e la ricerca emodinamica, e alla ricerca stereologia da disposizioniding un esatto terra-verità. In questo articolo descriveremo il gasdotto, compresa la preparazione del campione (fissaggio, colorazione, and Embedding), la configurazione e setup KESM, sezionamento e di imaging con la KESM, elaborazione delle immagini, la preparazione dei dati e visualizzazione dei dati e analisi. L&#39;accento sarà posto sulla preparazione dei campioni e la visualizzazione / analisi dei dati KESM ottenuti. Ci aspettiamo che il protocollo dettagliato presentato in questo articolo per contribuire ad ampliare l&#39;accesso alle KESM e aumentare il suo utilizzo.

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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

L&#39;intero processo, dalla preparazione del campione di cervello di serie di immagini utilizzando il sezionamento Knife-Edge microscopio a scansione, alla visualizzazione dei dati e l&#39;analisi è descritta. Questa tecnica è attualmente utilizzata per acquisire dati cervello di topo, ma è applicabile ad altri organi, altre specie.

Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d&#39;analisi per Knife-edge Microscopia Scansione

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