Name: specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
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이 프로젝트는 NSF (# 0905041, # 0079874), 텍사스 고급 기술 프로그램 (# ATP - 000512-0146 - 2001, # ATP - 000512-0261 - 2001), 텍사스는 (# 1R01 - NS54252) NIH / NINDS에 의해 투자되었다 A &amp; M 학술 진흥 재단, 텍사스 A &amp; M 대학, 3Scan에서 컴퓨터 과학 및 공학과. 우리는 기술 상담 KESM 장비에 대한 지원 버나드 메사 (마이크로 스타 기술)을 감사드립니다. KESM의 설계 및 구현의 주요 부분이 2007 년 사망 브루스 H. 맥코믹에 의해 수행되었다.

1. 표본 준비 : 잠돌군 Zz - 콕스 <ol><li> 이 프로토콜은 밀접하게 Mayerich 외의 프로토콜. 7을 따릅니다. </li><li> C57BL/6J 마우스 isoflurane 흡입 마취를 사용하여 깊은 anesthetized하고 다음 참수. </li><li> 두뇌는 잠돌군 Zz - 콕스 고정 솔루션 (1 % 칼륨의 크롬, 1 % 칼륨 dichromate, 그리고 탈이온수에 1퍼센트 mercuric 염화)로 제거하고 배치됩니다. </li><li> 두뇌는 10~16주 동안 상온에서, 어둠 속에서 잠돌군 Zz - 콕스 솔루션에 남아있다. </li><li> 두뇌는 어둠 속에서 밤새 탈이온수에 씻어서 있습니다. </li><li> 씻어서 두뇌는 상온에서 어둠 속에 7-10일 위해 탈이온수에 5 % 수산화 암모늄 용액에 포장되어 있습니다. 이 긴 준비 시간은 검은 침전물이 완전히 조직 형태에 대한 기회가되도록, 전체 두뇌의 침투를 보장하는 것이었다. </li><li> 두뇌는 4 시간 t에 대한 실온에서 탈이온수 다시 씻어서입니다실온에서 50 % 70% 냉장고 (4 ° C)에서 85 %, 95 % (3 변경) 및 100 % (4-5 변경) : 등급 에틸 알콜의 시리즈를 통해 탈수 암탉. 두뇌는 24 시간 동안 각각의 용액에 남아 있습니다. </li><li> 탈수 두뇌는 다음 1시 2분의 araldite - 투 - 아세톤 비율 1시 1분, 2시 1분, 마지막에있는 araldite - 아세톤 혼합하여 다음 (3-4 변경, 하루마다) 아세톤에 들어가게된다 냉장고에 100 % araldite (3 변화, 하루 때마다), (4 ° C). </li><li> 마지막으로 치료 두뇌는 100 % araldite에 포함된 및 ° C 삼일 (애보트와 Sotelo 2를 참조하라의 내장 프로토콜)에 대한 60 가열합니다. 표본은 LR 화이트에 포함된 경우 다음 표본 전에 중합에 대한 표준 절차 각 하룻밤 냉장고에 보관 LR 화이트 솔루션의 세 변화를 통해 지난 100 % 에탄올 용액에서 전송됩니다. 세 가지 변경 사항은 전체 침입을 보장하기 위해 수행됩니다. 표본은 t이다60 닫힌 용기에 polymerized는 신선한 LR 화이트로 전송 암탉 ° 적절한 중합 시간 및 온도의 필요한 금액 24 시간 C,. </li><li> 그림. 1 Araldite에 포함된 잠돌군 Zz - 콕스 묻은 머리를 보여줍니다. </li><li> 완치 표본 블록은 다음 에폭시를 사용하여 금속 표본 링에 장착하고, 블록의 측면은 (그림을 참조하십시오. 2) 필요로 손질합니다. </li></ol> 2. 표본 준비 : Nissl <ol><li> 마우스 케타민을 및 xylazine (1.7 MG 케타민을 / 20g의 체중 당 0.26 MG의 xylazine) 주입 intraperitoneally를 사용하여 깊은 anaesthetized하고 다음 transcardially 실온 50 ML을 사용 perfused 인산 버퍼 객실 250 ML 다음 염분을 (산도 7.4) 온도 중립 10 % (산도 7.4) 포르말린을 버퍼. 그리고 마지막으로 undiluted 인도 잉크의 3.0 CC와 함께. </li><li> 염분과 정착액과 함께 온몸 재관류는 심장 혈관 시스템에서 혈액을 취소하고 TI를 해결하는 데 필요한<html> ssues. 인도 잉크와 재관류 완전히 심장 혈관 시스템의 vasculature을 채우기 위해 필요합니다. </li><li> 그 결과 뇌는 등급 에틸 알콜 (25 % -100 %)의 시리즈를 통해 다음 탈수하고 다음 위의 1.8-1.9에서 다음과 같은 프로토콜 araldite 플라스틱에 포함된. LR 화이트 포함 매체있다면 위의 1.10의 프로토콜은 다음입니다. </li></ol> 4. 표본 준비 : 일반 종, 일반 기관 <ol><li> 일반적인 경우를, 고정가 중 10% 중성 포르말린 버퍼 또는 4 % paraformaldehyde로 할 수 있습니다. </li><li> 작은 조직 볼륨 대신 재관류의 보급은 고정 및 얼룩을 권장합니다. 작은 생물이나 기관의 경우도 얼룩은 탈수 과정에서 할 수 있습니다. </li><li> 솔루션 침투를위한 시간이 기관 또는 전체 마우스 뇌보다 훨씬 작은 생물에 대한 줄일 수 있지만 내장 프로토콜은 상기와 동일합니다. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. KESM 설정 및 이미징 <ol><li> 펌프를 끄고, 무대 설정 카메라 설정, 조명기 켭니다. </li><li> 나이프와 목적을 올립니다. </li><li> 표본 반지를 설치합니다. </li><li> 측정 표본의 크기와 KESM 스테이지 Controller2 응용 프로그램 구성 파일을 만듭니다. </li><li> KESM 단계 Controller2를 시작하고 무대를 초기화합니다. </li><li> 낮은 칼 / 목표, 펌프를 켜십시오. </li><li> 광학 기차에 초점 노브를 돌려 칼날에 상대적인보기의 카메라의 필드를 조정하여, 객관적이고 카메라를 중점을두고 있습니다. </li><li> 이미징을 시작 [이동]을 누르십시오. </li><li> 참조은 무화과. 3-8. 기술적인 세부 9, 7을 참조하십시오. </li></ol> 6. 영상 처리 및 데이터 준비 <ol><li> 설정 파일 폴더 (00000, 00001 등)에서 데이터 폴더로 KESM 스택 프로세서 실행 파일을 복사합니다. </li><li> 조명 유물을 제거하고 모든 배경 강도를 정상화하기 위해 KESM 스택 프로세서를 실행이미지를 표시합니다. 모든 데이터 하위 폴더에 대한 반복합니다. </li><li> 데이터 multiscale 타일을 준비 설정하고 업로드하고 KESM 두뇌 아틀라스 웹 서버에있는 파일을 설정합니다. </li><li> 그림을 참조하십시오. 9. </li></ol> 7. 데이터 시각화 및 분석 <ol><li> KESM 뇌 아틀라스를 사용하여 시각화. 이동 <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> 하고 해당 아틀라스를 선택합니다. <ol><li> Google지도에서와 같이 이동합니다. </li><li> Google Maps에로와 축소. </li><li> [-] Z 깊이를 증가 또는 감소에 다른 깊이로 이동하려면, 중 [+] 또는 누른 다음 풀다운 메뉴에서 각각의 단계에서 이동하는 방법에 깊이를 선택합니다. </li><li> 풀다운 메뉴를 사용하여 오버레이 번호를 조정합니다. </li><li> 풀다운 메뉴를 사용하여 오버레이 간격을 조정합니다. </li><li> 그림을 참조하십시오. 11. </li></ol></li><li> MeVisLab를 사용하여 시각화. <ol><li> MeVisLab를 시작합니다. </li><li> 새 프로젝트를 만듭니다. </li><li> 다음에, 새로운 모듈을 타이로 만들 수 있습니다명령 상자에서 모듈 이름으로 Ping을 실행합니다. </li><li> 생성 모듈 [Compose3Dfrom2DFiles], 그리고 원하는 폴더로 이동합니다. 파일 문자열을 입력하고 [GetFileList]을 클릭합니다. 선택된 이미지가 메모리에 들어갈 수 있는지 확인하십시오. 클릭하여 [Create3D]는 볼륨을 만들 수 있습니다. </li><li> 생성 모듈 [SetWorldMatrix] 아래에 &quot;크기 조정&quot;을 설정 해당 voxel 크기 (0.6, 0.7, 10X 0.45NA 목적을 위해 1.0)로 X, Y, Z &quot;를 초등학교가 변환&quot;. 링크 [Compose3Dfrom2DFiles]을 [SetWorldMatrix]. </li><li> 매트릭스를 설정하고 &quot;앞으로&quot;, &quot;무시&quot;, &quot;무시&quot;를 &quot;매트릭스 구성&quot;아래 변환. </li><li> 생성 모듈 [Arithmetic1]와 &quot;(맥스 IMG) 반전&quot;에 &quot;기능&quot;을 설정합니다. 링크 [SetWorldMatrix]을 [Arithmetic1]. </li><li> 생성 모듈 [View3D] 및 [Arithmetic1]를 연결합니다. </li><li> View3D에서 마우스 오른쪽 버튼을 누를 동안 임계값을 조정 주위 마우스를 이동합니다. 당신은 지역 변경 방향 (왼쪽 마우스 버튼을 누를있는 동안 마우스 이동), 변경 조명을 (볼륨 renderin 작물 수 있습니다G 또는 MIP) 등에 / 배경 해제 </li><li> 그림을 참조하십시오. 10. </li></ol></li></ol> 8. 대표 결과 : 여기, 우리는 전체 - 뇌 데이터와 정보를 제시한다. 무화과. 12-15보기 전체 - 뇌 인도 잉크, 잠돌군 Zz, 그리고 Nissl 데이터는 1, 4, 3을 설정합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" /> 그림 1., 고정 스테인드 및 임베디드 마우스 뇌 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" /> 그림 2. 임베디드 마우스 뇌 표본은 표본 링에 장착. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" /> 그림 3. 나이프 에지 스캐닝 현미경 (KESM). KESM의 사진은 자사의 주요 구성 요소가 표시와 함께 표시됩니다 : (1) 고속 라인 스캔 카메라 (2) 현미경의 목적, (3) 다이아몬드 나이프 어셈블리 및 조명 콜리 메 이터를 (4) specimen 탱크 (물 침지 영상에 대한), (5) 세 축 정밀 에어 베어링 스테이지 (6) 흰색 가벼운 현미경 조명기, sectioned 조직의 제거 (7) 펌프 (뒤쪽), (8) 무대 제어 및 이미지 수집, (9) 화강암베이스, 그리고 (10) 화강암 다리를 PC 서버. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" /> 그림 4. KESM의 이미징의 원칙. KESM 운영의 주요한는 그림입니다. 객관적이고 나이프는 (폭 5mm 표본 20 NM 및 1-5의 여행 속도의 해상도에서 위치 단계 이동 (실선과 화살표)에 부착된 동안 장소에서 개최되며, 다이아몬드 나이프에 대한 스크랩한 도착 10X 목적을 위해), 칼 (실선과 화살표)를 통해 흐르는 얇은 섹션을 생성. 라인 스캔 영상은 칼로의 매우 끝 가까이에 이루어집니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" /> 그림 5. KESM 카메라와 목표를 중심으로 제어합니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" /> 그림 6. KESM 나이프 어셈블리 및 제어합니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" /> 그림 7. 관측 포트를 통해 초점을 초기. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" /> 그림 8. KESM 스테이지 컨트롤러 2 응용 프로그램 (스크린샷). <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" /> 그림 9. KESM 스택 프로세서 응용 프로그램 (스크린샷). <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" /> 그림 10. MeVisLab 응용 프로그램 (스크린샷). <img alt="그림 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" /><br/&gt; 그림 11 KESM 뇌 아틀라스 :. 웹 인터페이스 (스크린샷). <img alt="그림 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" /> 그림 12. KESM 전체 - 뇌 인도 잉크 데이터입니다. KESM 데이터 스택의 볼륨 시각화는 혈관 데이터 집합에 대한 표시됩니다. (A) 클로즈업 혈관 데이터. 폭 ~ 100 음. 전체 마우스 뇌 vasculature의 (BD) 3 표준보기 (고해상도 데이터 subsampled). 너비는 10mm ~. <img alt="그림 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" /> 그림 13. KESM 전체 - 뇌 마우스 잠돌군 Zz 데이터입니다. <img alt="그림 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" /> 그림 14. KESM 잠돌군 Zz 데이터 세부 사항. <img alt="그림 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" /> 그림 15. KESM 전체 - 뇌 Nissl 데이터입니다. (A) 클로즈업 N의issl 데이터가 없습니다. ~ 300 음 3. 전체 마우스 뇌 Nissl 데이터 (BD) 3 표준보기 (고해상도 데이터 subsampled). 크로스 섹션은 내부 구조의 명확한 보려면 표시됩니다.

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	<li>Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+whole+small+animal+brains+with+the+knife-edge+scanning+microscope.">High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, (2008).</li><li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices.">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -. F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging,+analysis,+and+integration+of+mouse+brain+networks.">Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, (2010).</li><li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure:+Neurons+and+vasculatures.">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, (2009).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H., Ravi Rao, A., Cecchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy:+High-throughput+imaging+and+analysis+of+massive+volumes+of+biological+microstructures.">Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures.</a> High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. , 11-37 (2008).</li><li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope.">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, 136-136 (2010).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM.">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li><li>McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Brain+Tissue+Scanner.">Development of the Brain Tissue Scanner.</a> Technical Report. , (2002).</li><li>Sporns, O., Tononi, G., K&#246;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+connectome:+A+structural+description+of+the+human+brain.">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li></ol>

토드 호프만은 3Scan, KESM 기술 (미국 특허 # 6,744,572)를 제조하고 시장에 상업적인 회사입니다.

KESM은 생물 학적 표본 (~ 1cm 3) 대량의 submicrometer 수준의 조사를 허용합니다. 볼륨의이 종류가 같은 뇌, 폐, 심장, 신장 등 모든 작은 동물 장기를 가질 정도이며, 등 이러한 기관의 구조 조직에 대한 전례없는 양적 정보를 제공하고, 다양한 기능의 전산 모델링을 활성화할 수 같은 기관에서 이미지를 검색 회로 및 네트워크 역학, 전기적 특성, 유체 및 공기 흐름 역학, 그리고 근육의 역학을 포함하여 이들 기관의 측면. 이 문서에서 자세한 표본 준비 프로토콜 및 사후 분석 프로토콜 KESM에 쉽게 액세스하여 결과 데이터를 가지고 외부 연구 그룹을 도울 것으로 예상된다. KESM 작업 프로토콜이 독특한 이미징 양상의 장점과 제한 사항을 감사하기 위해 이러한 외부 연구자 도움이 될 것입니다.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

specimen preparation, imaging, and analysis protocols for knife-edge scanning microscopy

높은 처리량, 높은 해상도, 3D 현미경 기술의 주요 발전 submicrometer 해상도 neuroanatomical 큰 데이터 볼륨의 인수를 사용할 수있다. 전체 - 뇌 규모의 데이터를 생산 최초의 악기 중 하나는 나이프 - 에지 스캐닝 현미경 (KESM) 7, 5, 9, 개발 및 저자의 실험실에서 호스팅됩니다. KESM는 복잡한의 연결 네트워크의 세부 사항 (잠돌군 Zz) 1, 4, 8, 혈관 네트워크 (인도 잉크) 1, 4, 및 세포 본문 배포 (Nissl) 3 공개, 섹션 및 submicrometer 해상도에서 이미지 전체를 마우스 뇌에 사용되고 있습니다 . KESM의 사용은 마우스이나 두뇌에 제한되지 않습니다. 우리는 성공적으로 문어의 두뇌 6, 마우스 폐, 및 쥐 두뇌를 몇 군데있다. 현재 전체 제브라 다 니오의 배아에 노력하고 있습니다. microcirculation 및 hemodynamic 연구,, 이런 데이터는 크게 connectomics 연구 10 기여할 수 있으며, provi에 의해 stereology 연구에땡 지상 진실을 정확하게. 이 문서에서는, 우리는 표본 준비 (고정, 얼룩 및 포함)를 포함 파이프라인, KESM 구성 및 설정, sectioning 및 이미징 KESM와 함께, 이미지 처리, 데이터 준비, 데이터 시각화 및 분석에 대해 설명합니다. 강조 표본 준비와 얻은 KESM 데이터의 시각화 / 분석됩니다. 우리는이 문서에서 제시한 자세한 프로토콜 KESM하고 활용도를 높이기 위해 접근을 확대 데 도움을 기대합니다.

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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

뇌 표본 준비에서 데이터 시각화 및 분석에, 나이프 - 에지 스캐닝 현미경을 사용하여 시리얼 sectioning 이미징의 전체 과정을 설명합니다. 이 기술은 현재 마우스 뇌 데이터를 취득하는 데 사용하지만, 다른 기관, 다른 수종에 적용됩니다.

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