Name: performing custom microrna microarray experiments
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Arbejdet blev støttet delvist af National Institute of Drug Abuse Center (P50 DA 011.806) og United States Army Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).

1. Udskrivning af brugerdefinerede miRNA microarrays <ol><li> Udskriv microarray dias ved hjælp af microarray core facility services på et universitet eller en virksomhed. Kvaliteten af ​​microarray fabrikation er en af ​​de mest kritiske faktorer for succes i en microarray eksperiment. Prøv et par tjenester, hvis det er muligt. Ideelt set ville man udskrive 50-100 dias ad gangen, og alle dias vil se ens ud, med godt adskilte, individuelle pletter. </li><li> For microarray support, bruger vi de huller II-be...

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

Trods nylige fremskridt i dyb sekventering teknologier, forbliver microarray en levedygtig valg for high-throughput analyse af DNA og RNA. Sammenlignet med dyb sekventering, microarray eksperimenter er billigere, og en typisk molekylærbiologisk laboratorium kan udføre de fleste af de eksperimenter og dataanalyse in-house, hvilket giver mulighed for fleksibilitet og sparer tid. I fremtiden er microarrays sandsynligvis velegnet til intensivt afhøre sæt af gener, fx kan alle eller en delmængde af de transkriptionsfakt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Elementer </th><th> Vendor </th><th> Katalog nummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> NCode flere arter miRNA Microarray Probe Set V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> Designet er baseret på miRBase Slip 9.0 (oktober 2006). Den indeholder ~ 1.140 uændret, 34-44 NT lange oligonukleotider som sonder for orm, flue, zebrafisk, mus, rotter, og menneskelige miRNA, og en række interne kontrol sonder såsom snoRNAs. De miRNA sonder er dubletter af de sekvenser supplement til modne miRNA, dermed størrelsen af ​​~ 44 nt. For analyse kan man fokusere på miRNA fra en bestemt genom (r) af interesse. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> Vi har også brugt beriget, små RNA-fraktion til mærkning, selv om den samlede RNA-prøver er hurtigere og lettere at forberede og at kvantificere og velegnet for downstream-applikationer såsom mRNA analyse. </td></tr><tr><td> T4 RNA-ligase 1 </td><td> New England Biolabs </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> Dette kit eller lignende produkter kan anvendes til at mærke eksperimentel RNA-prøver eller en kontrol RNA (i stedet for kontrol DNA) samt. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &#39; </td><td> Dharmacon </td><td> Skræddersyet </td><td> Små RNA fraktion kan ligeledes mærkes af ligatur. </td></tr><tr><td> CentriSep kolonner </td><td> Princeton separationer </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII belagt slide </td><td> Corning </td><td> 40004 </td><td> Andre typer af dias kan også anvendes. </td></tr><tr><td> Microarray hybridisering kamre </td><td> Corning </td><td> 2551 eller 40080 </td><td> Andre former for hybridisering kamre og dækglas bør også arbejde. Brug af kommercielt tilgængelige hybridisering maskiner kan reducere hybridisering tid betydeligt, fx til ~ 2 timer. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ThErmo / Erie Videnskabelige </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

microRNA (miRNA) er en stor familie af ~ 22 nukleotider (NT) lange RNA molekyler, der er bredt udtrykt i eukaryoter 1. Komplekse genomer indkode mindst hundredvis af miRNA, der primært hæmmer udtryk for et stort antal af mål gener efter transcriptionally 2, 3. miRNA styre en bred vifte af biologiske processer 1. Hertil kommer, har ændret miRNA udtryk været forbundet med menneskelige sygdomme såsom kræft, og miRNA kan tjene som biomarkører for sygdomme og prognose 4, 5. Det er derfor vigtigt, at forstå udtryk og funktioner miRNA under mange forskellige forhold. Tre store tilgange har været ansat for at profilere miRNA udtryk: real-time PCR, microarray og dybe sekventering. Teknikken af ​​miRNA microarray har den fordel, at high-throughput, generelt billigere, og de fleste af de eksperimentelle og analyse trin kan CarrIED i et molekylærbiologisk laboratorium på de fleste universiteter, medicinske skoler og tilknyttede hospitaler. Her beskriver vi en metode til at udføre brugerdefinerede miRNA microarray eksperimenter. En miRNA probe sæt vil blive trykt på objektglas til at producere miRNA microarrays. RNA er isoleret ved hjælp af en metode eller reagens, der bevarer små RNA arter, og derefter mærket med et fluorescerende farvestof. Som en kontrol, der henvises DNA oligonukleotider svarende til en delmængde af miRNA også mærket med en anden fluorescens farvestof. Henvisningen DNA vil tjene til at demonstrere kvaliteten af ​​dias og hybridisering, og vil også blive brugt til data normalisering. RNA og DNA er blandet og hybridiseret til en microarray slide indeholdende prober for de fleste af miRNA i databasen. Efter vask er det dias scannes for at få billeder og intensiteten af ​​de enkelte pletter kvantificeret. Disse rå signaler vil blive yderligere behandlet og analyseret som et udtryk data i de tilsvarende miRNA. Microarray slides kan fjernes, og regenereres til at reducere omkostningerne ved microarrays og styrke sammenhængen i microarray eksperimenter. De samme principper og procedurer, som gælder for andre typer af brugerdefinerede microarray eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

En simpel procedure til at udføre brugerdefinerede microRNA microarray eksperimenter er beskrevet. Trinene omfatter isolere RNA, mærkning RNA og reference DNA, hybridizing prøverne til microarrays, scanning af microarrays, kvantificere og analysere hybridisering signaler.

Udførelse Brugerdefineret MicroRNA Microarray Eksperimenter

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Genome Redigering med CompoZr tilpassede zink finger Nucleaser (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering for formalin Faste nyrevæv

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

Ved hjælp af brugerdefinerede designet Galvanotaxis Chambers at studere Directional Migration af prostata celler

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

In Vivo Nanovector levering af en hjerte-specifikke MicroRNA-svamp

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

CRISPR-genredigeringsværktøj til analyse af mikroRNA-klynger

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...