Name: performing custom microrna microarray experiments
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Drug Abuse Center (P50 DA 011 806) og United States Army Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).

1. Trykking av tilpassede miRNA microarrays <ol><li> Skriv ut microarray lysbilder hjelp av microarray kjernen Facility Services ved et universitet eller en bedrift. Kvaliteten på microarray fabrikasjon er en av de mest kritiske faktorene for å lykkes med en microarray eksperiment. Prøv noen tjenester dersom mulig. Ideelt sett ville man print 50-100 lysbilder om gangen, og alle lysbildene vil se identiske, med godt atskilt, individuelle flekker. </li><li> For microarray støtte, bruker vi de hullene II belagt lysbi...

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

Til tross for nylige fremskritt i dyp sekvensering teknologier, forblir mikromatriser en levedyktig valg for high-throughput analyser av DNA og RNA. Sammenlignet med dype sekvensering, mikroarray eksperimenter er billigere, og en typisk molekylærbiologi laboratoriet kan utføre de fleste av forsøkene og dataanalyse i huset, noe som gir rom for fleksibilitet og sparer tid. I fremtiden microarrays er trolig godt egnet til intensivt forhøre sett av gener, for eksempel, kan alle eller et delsett av transkripsjonsfaktorer...

<table border="1"><tbody><tr><th> Elementer </th><th> Vendor </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> Designet er basert på miRBase År 9.0 (oktober 2006). Den inneholder ~ 1140 umodifisert, 34-44 nt lange oligonukleotider som prober for mark, flue, sebrafisk, mus, rotte, og menneskelig miRNAs, og en rekke interne kontroll prober som snoRNAs. Den miRNA prober er dubletter av sekvensene komplementære til modne miRNAs, derav størrelsen på ~ 44 nt. For analyse kan man fokusere på miRNAs fra et bestemt genom (s) av interesse. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> Vi har også brukt beriket, små RNA brøkdel for merking, men total RNA prøvene er raskere og enklere å forberede og å kvantifisere og egnet for downstream applikasjoner som mRNA analyse. </td></tr><tr><td> T4 RNA ligase 1 </td><td> New England Biolabs </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> Dette settet eller lignende produkter som kan brukes til å merke eksperimentelle RNA prøver eller en kontroll RNA (i stedet for kontroll DNA) i tillegg. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &#39; </td><td> Dharmacon </td><td> Skreddersydde </td><td> Små RNA brøkdel kan være tilsvarende merket med ligation. </td></tr><tr><td> CentriSep kolonner </td><td> Princeton Separasjoner </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII belagt skyv </td><td> Corning </td><td> 40004 </td><td> Andre typer skred kan også benyttes. </td></tr><tr><td> Microarray hybridisering kamre </td><td> Corning </td><td> 2551 eller 40080 </td><td> Andre typer hybridisering kamre og Dekkglass bør også fungere. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige hybridisering maskiner kan redusere hybridisering betraktelig, for eksempel til ~ 2 timer. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> Thermo / Erie Scientific </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

microRNAs (miRNAs) er en stor familie med ~ 22 nukleotider (nt) lang RNA-molekyler som er mye uttrykt i eukaryoter 1. Komplekse genomer kode minst hundrevis av miRNAs, som primært hemmer uttrykk for et stort antall mål gener post-transcriptionally 2, 3. miRNAs kontrollerer et bredt spekter av biologiske prosesser 1. I tillegg har endret miRNA uttrykk vært forbundet med menneskelige sykdommer som kreft, og miRNAs kan tjene som biomarkører for sykdom og prognose 4, 5. Det er derfor viktig å forstå uttrykk og funksjoner miRNAs under mange forskjellige forhold. Tre store tilnærminger har vært ansatt til profilen miRNA uttrykk: real-time PCR, mikromatriser, og dype sekvensering. Teknikken av miRNA microarray har fordelen av å være high-throughput, generelt mindre kostbare, og det meste av det eksperimentelle og analyse skritt kan være CarrIED ut i en molekylærbiologisk laboratorium ved de fleste universiteter, medisinske skoler og tilhørende sykehus. Her beskriver vi en metode for å utføre tilpassede miRNA microarray eksperimenter. Et miRNA probe settet vil bli trykket på glass lysbilder å produsere miRNA mikromatriser. RNA er isolert ved hjelp av en metode eller reagens som bevarer små RNA arter, og deretter merket med fluorescens fargestoff. Som en kontroll, er referanse DNA-oligonukleotider tilsvarende en undergruppe av miRNAs også merket med en annen fluorescens fargestoff. Henvisningen DNA vil tjene til å demonstrere kvaliteten av rasgropa og hybridisering og vil også bli brukt for data normalisering. RNA og DNA er blandet og hybridisert til en microarray skyve inneholder prober for det meste av miRNAs i databasen. Etter vask, er lysbildet skannes å få bilder, og intensiteter av de enkelte stedene tallfestet. Disse rå signalene vil bli videre bearbeidet og analysert som uttrykk data av tilsvarende miRNAs. Microarray lysbilder kan være strippet og regenereres for å redusere kostnadene ved mikromatriser og å forbedre konsistensen av microarray eksperimenter. De samme prinsipper og prosedyrer som gjelder for andre typer tilpassede microarray eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

En enkel prosedyre å utføre tilpassede mikroRNA microarray eksperimenter er beskrevet. Trinnene omfatter isolere RNA, merking RNA og referanse DNA, hybridizing prøvene til microarrays, skanning microarrays, kvantifisere og analysere hybridisering signaler.

Utføre Custom mikroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Genome Redigerer med CompoZr Custom sink finger nukleaser (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MikroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering for formalinfiksert Nyre Vev

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

Utnytte Spesialdesignede Galvanotaxis Chambers å studere Retnings Migrasjon av prostata celler

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

I Vivo Nanovector levering av en hjerte-spesifikke MicroRNA-svamp

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

CRISPR-genredigeringsverktøy for analyse av mikroRNA-klyngenettverk

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...