Name: performing custom microrna microarray experiments
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Arbetet stöddes delvis av National Institute of Drug Abuse Center (P50 DA 011.806) och USA: s armé Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).

1. Utskrift av anpassade miRNA microarrays <ol><li> Skriv ut microarray bilder med hjälp av microarray tjänster core facilitet vid ett universitet eller ett företag. Kvaliteten på microarray tillverkning är en av de mest kritiska faktorerna för att lyckas med en microarray experiment. Prova att ett fåtal tjänster om möjligt. Helst skulle man skriva ut 50-100 diabilder i taget, och alla bilder ser identiska, med väl separerade, enskilda platser. </li><li> För microarray stöd använder vi the Gaps II belagda...

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

Trots den senaste tidens framsteg i djup sekvenseringsteknologier förblir microarray ett lönsamt val för high-throughput analyser av DNA och RNA. Jämfört med djupa sekvensering, microarray experiment är billigare, och en typisk molekylärbiologiska laboratoriet kan utföra de flesta av de experiment och dataanalys i egen regi, som möjliggör flexibilitet och sparar tid. I framtiden mikroarrayer sannolikt väl lämpade för intensivt förhöra uppsättningar gener, t ex kan hela eller en delmängd av transkription...

<table border="1"><tbody><tr><th> Artiklar </th><th> Leverantör </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> NCode flera arter miRNA Microarray Probe Set V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> Designad baserat på miRBase Släpp 9,0 (oktober 2006). Den innehåller ~ 1140 oförändrade, 34-44 NT länge oligonukleotider som prober för mask, fluga, zebrafisk, mus, råtta och människa miRNA, och ett antal interna kontrollen sonder som snoRNAs. Mirna sonder är dubbletter av sekvenserna komplement till mogna miRNA, därav storleken på ~ 44 nt. För analys kan man fokusera på miRNA från en viss arvsmassa (er) av intresse. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> Vi har också använt berikat, små RNA-fraktion för märkning, även om det totala RNA-prover är snabbare och enklare att förbereda och att kvantifiera och lämplig för nedströms applikationer såsom mRNA analys. </td></tr><tr><td> T4 RNA ligas 1 </td><td> New England Biolabs </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis Alexa Fluor 647 nukleinsyra Labeling Kit </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> Detta kit eller liknande produkter kan användas för att märka experimentella RNA-prov eller en kontroll RNA (i stället för kontroll DNA) också. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &quot; </td><td> Dharmacon </td><td> Skräddarsydda </td><td> Små RNA-fraktionen kan vara lika märkas av ligatur. </td></tr><tr><td> CentriSep kolumner </td><td> Princeton Separationer </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII belagda bild </td><td> Corning </td><td> 40.004 </td><td> Andra typer av bilder kan också användas. </td></tr><tr><td> Microarray hybridisering kammare </td><td> Corning </td><td> 2551 eller 40.080 </td><td> Andra typer av hybridisering kammare och täckglas bör också fungera. Hjälp av kommersiellt tillgängliga hybridisering maskiner kan minska hybridisering tiden avsevärt, t.ex. till ~ 2 timmar. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ThErmo / Erie Vetenskapliga </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

mikroRNA (miRNA) är en stor familj av ~ 22 nukleotider (NT) långa RNA-molekyler som ofta uttrycks i eukaryoter 1. Komplexa arvsmassa kodar minst hundratals miRNA, som främst hämmar uttrycket av ett stort antal mål gener efter transkriptionellt 2, 3. miRNA styra ett brett utbud av biologiska processer 1. Dessutom har förändrat miRNA uttryck har associerats med mänskliga sjukdomar såsom cancer, och miRNA kan fungera som biomarkörer för sjukdomar och prognos 4, 5. Det är därför viktigt att förstå uttryck och funktioner miRNA under många olika förhållanden. Tre viktiga metoder har använts för att profilera miRNA uttryck: realtids-PCR, microarray, och djupa sekvensering. Tekniken att miRNA microarray har fördelen av att vara hög genomströmning i allmänhet billigare, och de flesta av de experimentella och analys steg kan CarrIED i en molekylärbiologiska laboratoriet vid de flesta universitet, medicinska skolor och tillhörande sjukhus. Här beskriver vi en metod för att utföra egna experiment miRNA microarray. En miRNA sond som ska skrivas ut på objektglas för att producera miRNA mikroarrayer. RNA är isolerad med hjälp av en metod eller reagens som bevarar små RNA-arter, och sedan märkt med fluorescens färgämne. Som en kontroll, är referens-DNA oligonukleotider motsvarar en delmängd av miRNA också märkt med en annan fluorescens färgämne. Hänvisningen DNA kommer att visa kvaliteten på bild och hybridisering och kommer också att användas för data normalisering. RNA och DNA blandas och hybridiseras till en microarray bild med sonder för de flesta av miRNA i databasen. Efter tvätt är bilden skannas för att få bilder och intensiteten hos enskilda platser kvantifieras. Dessa råa signaler kommer att ytterligare bearbetas och analyseras som ett uttryck uppgifter i motsvarande miRNA. Microarray diabilder kan avlägsnas och regenereras för att minska kostnaderna för microarrays och öka samstämmigheten i microarray experiment. Samma principer och förfaranden som gäller för andra typer av anpassade microarray experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

En enkel procedur för att utföra egna experiment mikroRNA microarray beskrivs. De steg som ingår isolera RNA, märkning RNA och referens-DNA, hybridisering proverna till mikroarrayer, skannar microarrays, kvantifiera och analysera hybridisering signaler.

Utföra Custom Experiment MikroRNA Microarray

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Gibberella zeae Ascospore Produktion och insamling för microarray experiment.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Beredning av Artificiell bilayers för elektrofysiologi Experiment

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Bearbetning av Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Global Gene Expression analys med en Zebrafish plattform Oligonucleotide microarray

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analys för Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Genome redigering med CompoZr anpassade nukleaser zink finger (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MikroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering för formalinfixerad njurvävnad

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

Använda Skräddarsydda Galvanotaxis Chambers att studera Directional Migration av prostataceller

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

In Vivo Nanovector leverans av en hjärta-specifika mikroRNA-svamp

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

CRISPR-genredigeringsverktyg för mikroRNA-klusternätverksanalys

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...