Name: encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
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National Heart, Lung and Blood Institute (Award # R00HL093358 zu LDB) - Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health unterstützt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Verkapselung von neugeborenen Ratten Kardiomyozyten in Fibringele Ergebnisse in einer konsistenten und tragfähigen dreidimensionalen in vitro Modell des myokardialen Systems. Fibrin ist ein bevorzugter Biomaterial, weil, wenn die Zellen eingeschlossen sind, sie metabolisch aktiv und in der Lage Verdichten, Umbau und Neuerstellung einer extrazellulären Matrix, die mit einheimischen Herzgewebe 12 ist sind. Weil wir die Herzmuskelzellen, sich in diesem Umfeld ausrichten zu können, ist ihre Funktion charakteristischer des Herzmuskels, was zu größeren Kontraktion Kraft zu isotropen Gewebe 6 verglichen. Für potenzielle therapeutische Anwendungen ist es notwendig, Zellen in einem Material, das sowohl die Lebensfähigkeit und Funktionalität fördert kapseln. Die Protokolle hier vorgestellten zeigen eine effiziente und genaue Mittel zur Schaffung eines Fibrin-Netzwerk, um Herzzellen Verhalten in einer dreidimensionalen Mikroumgebung kontrollieren. Ein paar mögliche Probleme können bei der Erstellung und Kultur dieser Konstrukte entstehen. Ein mögliches Problem ist die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen vor der Verkapselung, welche erhebliche Auswirkungen auf die Funktionalität des Konstrukts. Anstrengungen sollten unternommen werden, um den Zelltod nach der Trennung durch eine Verringerung der Zeit zwischen der Isolierung und der Kapselung der Zellen innerhalb des Fibringel zu begrenzen. Konstrukte sollten die Medien zur Verfügung gestellt werden jeden zweiten Tag auf einem strengen Zeitplan. Darüber hinaus ist es wichtig, um die Homogenität in allen verwendeten Lösungen zu gewährleisten. Wenn die Mischung von Fibrinogen, Thrombin und Zellen erzeugt eine heterogene Umgebung, die Fähigkeit der Zellen an die ECM-Umgestaltung, ist mechanisch zu koppeln und Vertrag möglicherweise behindert. Es ist auch wichtig, um die Bildung von Luftblasen bei der Injektion der Konstrukte zu vermeiden, um Störungen in der Kontinuität der gezüchteten Gewebe zu verhindern. Ein Weg, um dieses Problem zu lindern ziehen mehr Gel als notwendig, um das Konstrukt in die Spritze zu machen und injizieren langsam. Schließlich, nachdem die Fibrinmatrix gesetzt hat und hat in Kulturmedium für 24 Stunden, ist es wichtig, das Konstrukt von den Seiten der Ringform zu lösen, um die Zell-basierte Verdichtung des Fibringel fördern. Keeping das Konstrukt in der Mitte der Form erleichtert Gas-und Stoffaustausch. Die Einhaltung der Seiten der Ringform kann auch stören die gewünschte zelluläre Ausrichtung. Es ist wichtig zu beachten, dass bewusste Enthauptung als Methode der euthanization in diesem Protokoll, das eine akzeptable Methode nach den Richtlinien sowohl von der National Institutes of Health und der American Veterinary Medical Association ist, verwendet wird. Allerdings empfehlen einige Institutionen Betäubung Nutzung durch Enthauptung neugeborenen Ratten folgten. Wir haben bewusst Enthauptung gewählt, weil es die minimale Menge an Zeit, sorgt unter hypoxischen Bedingungen für die ausgeschnittenen Herzen Gewebe / Zellen. Relativ kleine Mengen von Hypoxie kann zu Ischämie und potenziell Myozyten Tod, der erheblich beeinflussen könnten die Ergebnisse dieses Protokoll Myozyten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Natriumdihydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Kaliumphosphat einbasischen </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91308-12 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> feinen Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> große Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91401-14 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Mikro-Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91501-09 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Skalpellgriff </td><td> Feine Science Tools </td><td> 10008-13 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Skalpell </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 bis 918-5A </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Absorbent Bank underpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> sterilen Tuch </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Autoklavierbeutel </td><td> Fischer </td><td> 01-812-54 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Gaze </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> betadine </td><td> Purdue Produkte </td><td> 67618-150-01 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> sterile Handschuhe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> sterile Transferpipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Kollagenase </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Teflonstab 1 / 4 Zoll Durchmesser </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Teflonschlauch 1 / 4 Zoll-ID, 1 / 2 Zoll OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Silikon O-Ring 1 / 4 Zoll-ID, 1 / 2 Zoll OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Teflonschlauch 1 / 4 Zoll-ID, 5 / 16 Zoll OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Kendall Monoject Spritzen 6cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> BD Spritze 3cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Bovine Fibrinogen </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Bovine Thrombin </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Kalziumchlorid </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 0,2 Mikron-Filter </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 40 Mikron Zelle Siebe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 0,45-Mikron-Bottle Top-Filters </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Glas-Vorfilter </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 Zoll lange Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 bis 826-5D </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 21G 1 inch Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> konstruieren Gläser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Aminocapronsäure </td><td> Acros Organics </td><td> 103305000 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, 16% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Optimale Schnittqualität Temperatur (OCT) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> 2-Methylbutan </td><td> Fischer </td><td> 03551-4 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Maus MYH1/2/4/6 Primärantikörper </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-32732 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Kaninchen Connexin 43 Primärantikörper </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 3512 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> DyLight 549-konjugierten Esel-anti-Maus-sekundären Antikörper </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 715-505-151 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> DyLight 488-konjugierten Donke Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 711-485-152 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Live / Dead Assay </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Analyse </td></tr></tbody></table>

encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering

Kultivieren von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung Hydrogel ist eine wichtige Technik für die Entwicklung Konstrukte für das Tissue Engineering sowie dem Studium zellulärer Reaktionen unter verschiedenen Kulturbedingungen in vitro. Die dreidimensionalen Umgebung genauer imitiert, was die Zellen in vivo beobachten, durch die Anwendung von mechanischen und chemischen Reizen in allen Dimensionen 1. Dreidimensionale Hydrogele können entweder aus synthetischen Polymeren wie PEG-DA 2 und PLGA 3 oder eine Reihe von natürlich vorkommenden Proteinen wie Kollagen 4, Hyaluronsäure 5 oder Fibrin 6,7 vorgenommen werden. Hydrogele aus Fibrin, einem natürlich vorkommenden Blutgerinnungsproteins, erstellt wurden, können polymerisieren zu einem Netz, das Teil des körpereigenen natürlichen Wundheilung 8 ist zu bilden. Fibrin ist Zell-abbaubar und potenziell autologen 9, ist damit ein idealer temporäre Gerüst für das Tissue Engineering. Hier haben wir im Detail beschreiben die Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten aus drei Tage alten neugeborenen Ratten und die Vorbereitung der Zellen für die Verkapselung in Fibrin-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Engineering. Neonatal Myozyten sind eine häufige Quelle für Zellen in vitro-Studien im Herzgewebe Bildung und Technik 4 verwendet. Fibrin-Gel wird durch Mischen von Fibrinogen mit dem Enzym Thrombin erstellt. Thrombin spaltet Fibrinopeptide FpA und FpB aus Fibrinogen und enthüllt Bindungsstellen, die mit anderen Monomeren 10 zusammenwirken. Diese Wechselwirkungen führen die Monomere in Fasern, die das Hydrogel Mesh Form selbst zusammen. Da der Zeitpunkt für diese enzymatische Reaktion, indem das Verhältnis von Thrombin, Fibrinogen oder das Verhältnis von Calcium zu Thrombin eingestellt werden kann, kann man Spritzgießwerkzeug Konstrukte mit einer Reihe von unterschiedlichen Geometrien 11,12. Weiterhin können wir die Ausrichtung der resultierenden Gewebe, wie wir beschränken das Gel während der Kultur 13 erzeugen. Nach Kultivierung der technisch Herzgewebe Konstrukte für zwei Wochen unter statischen Bedingungen, die Herzzellen begonnen, das Konstrukt umgestalten und kann eine Kontraktion Kraft unter elektrischer Stimulation Bedingungen 6 zu erzeugen. Als Teil dieses Protokoll, beschreiben wir auch Methoden zur Analyse der Gewebezüchtung Myokard nach der Kultur Zeitraum einschließlich der funktionalen Analyse der aktiven Kraft des Herzmuskels erzeugt bauen auf elektrische Stimulation, sowie Methoden zur Bestimmung der endgültigen Lebensfähigkeit der Zellen (Live-Dead assay) und immunhistologische Färbung, um den Ausdruck und die Morphologie der typischen Proteine ​​wichtig für die Kontraktion (Myosin Heavy Chain oder MHC) und zellulären Kopplung (Connexin 43 oder Cx43) zwischen Myozyten zu untersuchen.

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Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Wir beschreiben die Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten und die Vorbereitung der Zellen für die Verkapselung in Fibrin-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Engineering. Wir beschreiben Methoden zur Analyse der Gewebezüchtung Myokard nach der Kultur Zeitraum einschließlich der aktiven Kraft auf elektrische Stimulation und die Lebensfähigkeit der Zellen und immunhistologische Färbung erzeugt.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

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