Name: encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
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राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (अवार्ड # R00HL093358 LDB) - यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया था.

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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

आतंच जैल में एक सुसंगत और व्यवहार्य myocardial प्रणाली के इन विट्रो मॉडल में तीन आयामी परिणामों में नवजात चूहे cardiomyocytes के encapsulation. आतंच एक पसंदीदा biomaterial है क्योंकि जब कोशिकाओं फँस कर रहे हैं, वे metabolically सक्रिय और compacting, remodeling और है कि देशी हृदय ऊतक 12 के साथ संगत है एक बाह्य मैट्रिक्स पुनः बनाने में सक्षम हैं. क्योंकि हम cardiomyocytes इस माहौल में खुद को संरेखित करने के लिए अनुमति देते हैं, उनकी कार्यक्षमता अधिक हृदय बड़ा संकुचन बल में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में isotropic 6 ऊतकों की तुलना में मांसपेशियों की विशेषता है. संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए, यह आवश्यक है एक सामग्री है कि दोनों व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को बढ़ावा के भीतर कोशिकाओं encapsulate. प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत आतंच नेटवर्क के लिए एक तीन आयामी microenvironment में हृदय सेल व्यवहार पर नियंत्रण बनाने के लिए एक कुशल और सटीक अर्थ प्रदर्शित. कुछ संभावित मुद्दों और इन constructs के सृजन और संस्कृति के दौरान उत्पन्न हो सकती है. एक संभावित मुद्दा encapsulation से पहले सेल व्यवहार्यता के रखरखाव, जो काफी का निर्माण की कार्यक्षमता को प्रभावित करेगा है. प्रयास अलगाव और आतंच जेल के भीतर कोशिकाओं के encapsulation के बीच के समय को कम करने से अलगाव के बाद कोशिका मृत्यु की सीमा के लिए किया जाना चाहिए. Constructs मीडिया प्रदान की जानी चाहिए हर दूसरे दिन एक सख्त समय पर. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है के लिए इस्तेमाल समाधान के सभी में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए. यदि फाइब्रिनोजेन, थ्रोम्बिन और कोशिकाओं के मिश्रण एक विषम वातावरण पैदा करता है, कोशिकाओं की क्षमता को ईसीएम फिर से तैयार करना, यंत्रवत् जोड़े और अनुबंध संभावित बाधित है. यह भी महत्वपूर्ण है constructs के इंजेक्शन के दौरान हवाई बुलबुले के गठन को रोकने के क्रम में इंजीनियर के ऊतकों की निरंतरता में गड़बड़ी को रोकने के. इस मुद्दे को कम करने का एक तरीका अधिक जेल से सिरिंज में का निर्माण बनाने के लिए और धीरे धीरे इंजेक्षन की जरूरत है आकर्षित है. अन्त में, एक बार आतंच मैट्रिक्स सेट है और 24 घंटे के लिए संस्कृति के माध्यम में किया गया है, यह आवश्यक है का निर्माण रिंग मोल्ड के पक्ष से अलग आतंच जेल के सेल आधारित संघनन को बढ़ावा देने के. आचारण के मध्य में निर्माण को ध्यान में रखते हुए गैस और पोषक तत्वों की विनिमय की सुविधा. रिंग मोल्ड के पक्ष के पालन में भी वांछित सेलुलर संरेखण को बाधित कर सकते हैं. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि होश में शिरच्छेद इस प्रोटोकॉल में euthanization की विधि है, जो दोनों स्वास्थ्य और पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन के राष्ट्रीय संस्थानों से दिशा निर्देशों के तहत एक स्वीकार्य तरीका है के रूप में प्रयोग किया जाता है है. हालांकि, कुछ संस्थाओं संवेदनाहारी नवजात चूहों के लिए कत्ल के बाद उपयोग की सलाह देते हैं. हम होश में कत्ल को चुना है क्योंकि यह excised हृदय के ऊतकों / कोशिकाओं के लिए hypoxic शर्तों के तहत समय की न्यूनतम राशि सुनिश्चित करता है. Hypoxia के अपेक्षाकृत छोटे मात्रा ischemia और संभावित myocyte मृत्यु है, जो काफी इस प्रोटोकॉल के परिणामों को प्रभावित कर सकता myocyte नेतृत्व कर सकते हैं.

<table border="1"><tbody><tr><th> अभिकर्मक के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th><th> टिप्पणियाँ </th></tr><tr><td> सोडियम क्लोराइड </td><td> सिग्मा </td><td> S7653 </td><td> पीबीएस </td></tr><tr><td> पोटेशियम क्लोराइड </td><td> सिग्मा </td><td> P9333 </td><td> पीबीएस </td></tr><tr><td> सोडियम फॉस्फेट द्विबेसीय </td><td> सिग्मा </td><td> S7907 </td><td> पीबीएस </td></tr><tr><td> पोटेशियम फॉस्फेट एक भस्मक </td><td> सिग्मा </td><td> P5655 </td><td> पीबीएस </td></tr><tr><td> ग्लूकोज </td><td> सिग्मा </td><td> G5400 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 91308-12 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> ठीक चिमटी </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 11251-20 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> बड़ी कैंची </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 91401-14 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> सूक्ष्म - कैंची </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 91501-09 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> स्केलपेल संभाल </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 10008-13 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> स्केलपेल ब्लेड </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 08 918-5A </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> शोषक बेंच Underpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> बाँझ टांगना </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> GM42526 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> आटोक्लेव बैग </td><td> मछुआ </td><td> 01-812-54 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> धुंध पैड </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 13-761-52 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> betadine </td><td> पर्ड्यू उत्पाद </td><td> 67618-150-01 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> बाँझ दस्ताने </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 19-020 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> बाँझ हस्तांतरण विंदुक </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 9962 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> collagenase </td><td> वर्थिंगटन </td><td> CLS2 </td><td> अलगाव </td></tr><tr><td> Teflon 1 / 4 इंच व्यास छड़ी </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> मोल्ड हिस्सा </td></tr><tr><td> Teflon ट्यूब 1 / 4 इंच आईडी, 1 / 2 इंच आयुध डिपो </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> मोल्ड हिस्सा </td></tr><tr><td> सिलिकॉन O-अंगूठी 1 / 4 इंच आईडी, 1 / 2 इंच आयुध डिपो </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> मोल्ड हिस्सा </td></tr><tr><td> Teflon ट्यूब 1 / 4 इंच आईडी, 5 / 16 इंच आयुध डिपो </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> मोल्ड हिस्सा </td></tr><tr><td> केंडल monoject सीरिंज 6cc </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 05-561-41 </td><td> मोल्ड हिस्सा </td></tr><tr><td> बी.डी. सिरिंज 3CC </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 309585 </td><td> मोल्ड हिस्सा </td></tr><tr><td> गोजातीय फाइब्रिनोजेन </td><td> सिग्मा </td><td> F8630 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> गोजातीय थ्रोम्बिन </td><td> सिग्मा </td><td> T7513 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> 1 एम HEPES </td><td> सिग्मा </td><td> H0887 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> सोडियम क्लोराइड </td><td> सिग्मा </td><td> S7653 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> Pluronic एफ - 127 </td><td> सिग्मा </td><td> P2443 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> कैल्सियम क्लोराइड </td><td> सिग्मा </td><td> 383147 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> 0.2 माइक्रोन फिल्टर </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> SCGVT05RE </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> 40 माइक्रोन सेल strainers </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 22-363-547 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> 0.45 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर </td><td> कोर्निंग </td><td> 430627 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> पूर्व फ़िल्टर गिलास </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 इंच लंबी सुई </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 14-826-5D </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> 21G 1 इंच सुई </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 14-826C </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> जार का निर्माण </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 2116 </td><td> निर्माण </td></tr><tr><td> पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> मीडिया </td></tr><tr><td> घोड़ा सीरम </td><td> सिग्मा </td><td> H1138 </td><td> मीडिया </td></tr><tr><td> भ्रूण गोजातीय सीरम </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> मीडिया </td></tr><tr><td> aminocaproic एसिड </td><td> Acros ऑर्गेनिक्स </td><td> 103305000 </td><td> मीडिया </td></tr><tr><td> विटामीन सी </td><td> सिग्मा </td><td> A5960 </td><td> मीडिया </td></tr><tr><td> इन्सुलिन </td><td> सिग्मा </td><td> I9278 </td><td> मीडिया </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, 16% </td><td> इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान </td><td> 15710 </td><td> ऊतक विज्ञान </td></tr><tr><td> इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) </td><td> टेड पेला </td><td> 27050 </td><td> ऊतक विज्ञान </td></tr><tr><td> 2 - methylbutane </td><td> मछुआ </td><td> 03551-4 </td><td> ऊतक विज्ञान </td></tr><tr><td> माउस MYH1/2/4/6 प्राथमिक एंटीबॉडी </td><td> सांता क्रूज़ जैव प्रौद्योगिकी </td><td> SC - 32,732 </td><td> ऊतक विज्ञान </td></tr><tr><td> खरगोश 43 प्राथमिक एंटीबॉडी Connexin </td><td> संकेतन सेल प्रौद्योगिकी </td><td> 3512 </td><td> ऊतक विज्ञान </td></tr><tr><td> Dylight गधा 549 संयुग्मित विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी </td><td> जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं </td><td> 715-505-151 </td><td> ऊतक विज्ञान </td></tr><tr><td> Dylight 488 संयुग्मित Donke विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी </td><td> जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं </td><td> 711-485-152 </td><td> ऊतक विज्ञान </td></tr><tr><td> लाइव / मृत परख </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> विश्लेषण </td></tr></tbody></table>

encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

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Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

हम नवजात cardiomyocytes और आतंच ऊतक इंजीनियरिंग के लिए hydrogel constructs में encapsulation के लिए कक्षों की तैयारी के अलगाव का वर्णन. हम संस्कृति सक्रिय बिजली की उत्तेजना और सेल व्यवहार्यता और immunohistological धुंधला पर उत्पन्न बल सहित अवधि के बाद ऊतक इंजीनियर मायोकार्डियम का विश्लेषण करने के लिए विधियों का वर्णन.

Cardiomyocytes की कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक आतंच Hydrogel में इनकैप्सुलेशन

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

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