Name: encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
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国立心肺血液研究所（賞＃R00HL093358にLDB） - この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていました。

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	<li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. 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利害の衝突は宣言されません。

心筋システムのin vitroモデルにおける一貫性と実行可能な三次元におけるフィブリンゲルの結果の新生児ラット心筋細胞のカプセル化。細胞が捕捉されたとき、彼らは代謝活性と、コンパクト化改造およびネイティブの心臓組織12との一貫性のある細胞外マトリックスを再作成することが可能であるため、フィブリンが望ましい生体材料です。我々は心筋細胞はこの環境で自分自身を整列することを可能にするので、それらの機能は、等方性の組織6に比べてより大きな収縮力で、その結果心筋のより特徴的です。潜在的な治療のアプリケーションでは、それは実行可能性と機能性の両方を促進する物質の中で細胞をカプセル化する必要があります。プロトコルは、3次元の微小環境における心筋細胞の挙動を制御するために、フィブリンネットワークを作成するための効率的かつ正確な手段を示すここで紹介。 いくつかの潜在的な問題は、これらのコンストラクトの作成と培養中に発生する可能性があります。つの潜在的な問題は大幅に構造の機能に影響を与える前に、カプセル化に細胞の生存率の維持、である。努力が分離し、フィブリンゲル内の細胞のカプセル化の間の時間を減らすことによって、分離後の細胞死を制限するためになされるべきである。構文は、厳密なスケジュールで一日おきにメディアを提供する必要があります。さらに、使用されるソリューションのすべてに均一性を確保することが重要です。フィブリノーゲン、トロンビンと細胞の混合物は、異機種環境を生成する場合、ECMを改造する細胞の能力は、機械的に夫婦と契約が潜在的に遮断されていない。エンジニアリング組織の継続性の乱れを防ぐために、構造の注入時の気泡の形成を防止することも重要です。この問題を緩和する一つの方法は、シリンジに構造を作り、ゆっくりと注入する必要以上のゲルを描くです。最後に、一度フィブリンマトリックスが設定されていると24時間培養液中にされている、それはフィブリンゲルの細胞ベースの圧縮を促進するため、リング型の側面から構造を切り離すことが不可欠です。金型の中央に構造を維持すること、ガスと栄養素の交換が容易になります。リングの金型の側面への付着はまた、所望の細胞整列が中断される場合があります。 その意識断頭は国立衛生研究所の両方からのガイドラインの下で承認された方法とアメリカ獣医学協会であるこのプロトコルでは安楽死の方法として使用されている点が重要です。しかし、一部の金融機関は、新生児ラットの断頭続いて麻酔を使用することをお勧めします。それは、摘出した心臓組織/細胞のための低酸素条件下での時間の最小量を保証するため、我々は意識的な斬首を選択している。低酸素の比較的少量では虚血と有意にこのプロトコルの結果に影響を与える可能性のある潜在的に心筋細胞死を、筋細胞につながることができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ナトリウム塩化</td><td>シグマ</td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td>カリウム塩化</td><td>シグマ</td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td>ナトリウム二塩基性リン酸</td><td>シグマ</td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td>一塩基性リン酸カリウム</td><td>シグマ</td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td> G5400 </td><td>分離</td></tr><tr><td>止血剤</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 91308〜12 </td><td>分離</td></tr><tr><td>細かいピンセット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251〜20 </td><td>分離</td></tr><tr><td>大きなはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 91401〜14 </td><td>分離</td></tr><tr><td>マイクロはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 91501〜09 </td><td>分離</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10008〜13 </td><td>分離</td></tr><tr><td>メス刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 08から918 - 5A </td><td>分離</td></tr><tr><td>吸収ベンチunderpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td>分離</td></tr><tr><td>滅菌ドレープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> GM42526 </td><td>分離</td></tr><tr><td>オートクレーブバッグ</td><td>フィッシャー</td><td> 01-812-54 </td><td>分離</td></tr><tr><td>ガーゼのパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 13-761-52 </td><td>分離</td></tr><tr><td> betadine </td><td>パーデュー大学の製品</td><td> 67618-150-01 </td><td>分離</td></tr><tr><td>滅菌手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 19から020 </td><td>分離</td></tr><tr><td>無菌トランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 9962 </td><td>分離</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>ワージントン</td><td> CLS2 </td><td>分離</td></tr><tr><td>テフロンロッド1 / 4インチ直径</td><td>マクマスター - カー</td><td> 8546K11 </td><td>型の部</td></tr><tr><td>テフロンチューブ1 / 4インチID、1 / 2インチOD </td><td>マクマスター - カー</td><td> 8547K31 </td><td>型の部</td></tr><tr><td>シリコンO -リング1 / 4インチID、1 / 2インチOD </td><td>マクマスター - カー</td><td> 9396K204 </td><td>型の部</td></tr><tr><td>テフロンチューブ1 / 4インチID、5 / 16インチ外径</td><td>マクマスター - カー</td><td> 52355K14 </td><td>型の部</td></tr><tr><td>ケンドールmonojectシリンジ6cc </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 05-561-41 </td><td>型の部</td></tr><tr><td> BDシリンジ3CC </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 309585 </td><td>型の部</td></tr><tr><td>ウシフィブリノーゲン</td><td>シグマ</td><td> F8630 </td><td>構築する</td></tr><tr><td>ウシトロンビン</td><td>シグマ</td><td> T7513 </td><td>構築する</td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td>シグマ</td><td> H0887 </td><td>構築する</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S7653 </td><td>構築する</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 10569 </td><td>構築する</td></tr><tr><td>プルロニックF - 127 </td><td>シグマ</td><td> P2443 </td><td>構築する</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td> 383147 </td><td>構築する</td></tr><tr><td> 0.2ミクロンフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> SCGVT05RE </td><td>構築する</td></tr><tr><td> 40ミクロ​​ンのセルストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 22-363-547 </td><td>構築する</td></tr><tr><td> 0.45ミクロンのボトルトップフィルター</td><td>コー​​ニング</td><td> 430627 </td><td>構築する</td></tr><tr><td>ガラスプレフィルター</td><td>ミリポア</td><td> AP2007500 </td><td>構築する</td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2インチの長い針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14から826 - 5D </td><td>構築する</td></tr><tr><td> 21G 1インチの針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14 - 826C </td><td>構築する</td></tr><tr><td> jarファイルを構築する</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 2116 </td><td>構築する</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140 </td><td>メディアの</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>シグマ</td><td> H1138 </td><td>メディアの</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16000 </td><td>メディアの</td></tr><tr><td>アミノカプロン酸</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 103305000 </td><td>メディアの</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A5960 </td><td>メディアの</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td> I9278 </td><td>メディアの</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16％ </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td>組織学</td></tr><tr><td>最適な切削温度（OCT） </td><td>テッドペラ</td><td> 2705​​0 </td><td>組織学</td></tr><tr><td> 2 - メチルプタン</td><td>フィッシャー</td><td> 03551〜4 </td><td>組織学</td></tr><tr><td>マウスMYH1/2/4/6一次抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 32732 </td><td>組織学</td></tr><tr><td>ウサギコネキシン43の一次抗体</td><td>セルシグナリングテクノロジー</td><td> 3512 </td><td>組織学</td></tr><tr><td> Dylight 549 -結合ロバ抗マウス二次抗体</td><td>ジャクソンイムノ研究所</td><td> 715-505-151 </td><td>組織学</td></tr><tr><td> Dylight 488標識Donke抗ウサギ二次抗体</td><td>ジャクソンイムノ研究所</td><td> 711-485-152 </td><td>組織学</td></tr><tr><td> LIVE / DEADアッセイ</td><td>インビトロジェン</td><td> L - 3224 </td><td>分析</td></tr></tbody></table>

encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering

三次元ハイドロゲルの環境で培養する細胞は組織工学のための構造を開発するだけでなく、in vitroで種々の培養条件下で細胞応答を研究するための重要なテクニックです。三次元環境では、より密接に細胞が原因で、すべての次元1の機械的および化学的刺激のアプリケーションに、in vivoで観察するものを模倣している。三次元のヒドロゲルは、どちらかのようなPEG - DA 2およびPLGA 3またはそのようなコラーゲン4、ヒアルロン酸5またはフィブリン6,7のような天然のタンパク質の数などの合成高分子から行うことができます。フィブリン、天然由来の血液凝固タンパク質、から作成されたハイドロゲルは、身体の自然な創傷治癒のプロセス8の一部であるメッシュを形成するために重合することができます。フィブリンは、組織工学のために理想的な一時的な足場作り、細胞分解性と潜在的に自家9です。 ここでは、3つの日齢の仔ラットと組織工学のためのフィブリンハイドロゲルの構造でカプセル化するための細胞の調製から詳細に新生児心筋細胞の単離を説明します。新生児の心筋細胞は、心臓組織の形成と工学4のin vitro試験で使用される一般的な細胞源です。フィブリンゲルは、酵素トロンビンと混合フィブリノゲンによって作成されます。トロンビンは、他のモノマー10との相互作用の結合部位を明らかに、フィブリノーゲンからfibrinopeptides FPAとFPBを切断する。これらの相互作用は、単量体は、ヒドロゲルのメッシュを形成する繊維に自己集合させる。この酵素反応のタイミングがフィブリノゲンにトロンビンの比、またはトロンビンへのカルシウムの比率を変えることによって調整できるので、一つは射出成形金型は、異なる形状11,12の数で構築できます。さらに我々は文化は13ゲルを制約する方法により、結果として組織のアライメントを生成することができます。 培養静的条件下での二週間のための工学心臓組織の構成要素の後に、心臓の細胞が構造を改造し始めていると電気的ペーシングの条件6歳未満の収縮力を生成することができます。このプロトコルの一部として、我々はまた、機能的な心筋によって生成されたアクティブな力の分析、最終的な細胞の生存を決定するための電気刺激だけでなく、方法によって構築する（ライブデッド含む培養期間後に心筋の設計組織を分析するための方法を説明します。アッセイ）と収縮（ミオシン重鎖またはMHC）と心筋細胞間の細胞結合（コネキシン43またはCx43）のための重要な典型的なタンパク質の発現と形態を調べるために免疫組織染色。

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Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

我々は、新生児の心筋細胞と組織工学のためのフィブリンハイドロゲルの構造でカプセル化するための細胞の調製の分離を説明します。我々は、電気刺激と細胞の生存および免疫組織染色により発生する活性力を含む培養期間後に心筋培養組織を分析するための方法を説明します。

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