Name: encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud - Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (Premio # R00HL093358 a LDB).

<ol>
	<li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical,+biochemical,+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype.">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li><li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters.">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li><li>Krebs, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+poly(lactic-co-glycolic)+acid+scaffolds+with+in+situ+pore+formation+for+tissue+engineering.">Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering.</a> Acta. 5, 2847-2859 (2009).</li><li>Zimmermann, W. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts.">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature. 12, 452-458 (2006).</li><li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis.">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li><li>Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification.">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).</li><li>Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+distension+of+fibrin-based+tissue+constructs:+evidence+of+adaptation+during+growth+of+engineered+connective+tissue.">Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).</li><li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin.">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).</li><li>Jockenhoevel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+gel+-+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering.">Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).</li><li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology.">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li><li>Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sourcing+and+culture+conditions+for+fibrin-based+valve+constructs.">Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs.</a> Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).</li><li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibrin-based+arterial+media+equivalent.">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li><li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics:+the+interplay+among+cell+traction,+fibrillar+network+deformation,+fibril+alignment,+and+cell+contact+guidance.">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 .</li><li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> >LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells. , (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La encapsulación de los cardiomiocitos de rata neonatal en fibrina resultados geles de forma coherente y viable en tres dimensiones en el modelo in vitro del sistema de miocardio. La fibrina es una biomaterial preferido porque cuando las células están atrapados, son metabólicamente activa y capaz de compactar, remodelación y volver a crear una matriz extracelular que está en consonancia con el tejido del corazón nativo de 12. Porque permitimos que los cardiomiocitos a alinearse en este entorno, su funcionalidad es más característico del músculo cardíaco que resulta en la fuerza de contracción mayor en comparación con los tejidos isotrópico 6. Para posibles aplicaciones terapéuticas, es necesario encapsular las células dentro de un material que promueve tanto la viabilidad y funcionalidad. Los protocolos se presentan demuestran un medio eficiente y preciso para la creación de una red de fibrina para controlar el comportamiento de las células cardíacas en un microambiente tridimensional. A los posibles problemas de unos pocos puedan surgir durante la creación y la cultura de estas construcciones. Un problema potencial es el mantenimiento de la viabilidad de las células antes de la encapsulación, que afectarán de manera significativa la funcionalidad de la construcción. Debería hacerse lo posible para limitar la muerte celular tras el aislamiento, reduciendo el tiempo entre el aislamiento y la encapsulación de las células dentro del gel de fibrina. Construcciones deben ser siempre los medios de comunicación cada dos días en un horario estricto. Además, es importante para asegurar la homogeneidad en todas las soluciones que se utilizan. Si la mezcla de fibrinógeno, trombina y células produce un entorno heterogéneo, la capacidad de las células de la remodelación de la MEC, mecánicamente par y el contrato es potencialmente obstruida. También es importante para prevenir la formación de burbujas de aire durante la inyección de las construcciones con el fin de evitar perturbaciones en la continuidad de la ingeniería tisular. Una forma de aliviar este problema es atraer a más gel que se necesita para hacer la construcción en la jeringa e inyectar lentamente. Por último, una vez que la matriz de fibrina ha establecido y ha estado en medio de cultivo durante 24 horas, es esencial para separar la construcción de los lados del molde de anillo para promover la compactación a base de células de gel de fibrina. Mantener la construcción en el centro del molde facilita el gas y el intercambio de nutrientes. La adhesión a los lados del molde de anillo también puede alterar la alineación deseada celular. Es importante tener en cuenta que la decapitación consciente se utiliza como método de eutanasia en este protocolo, que es un método aceptable con arreglo a las directrices tanto del Instituto Nacional de Salud y la American Veterinary Medical Association. Sin embargo, algunas instituciones recomiendan el uso de anestesia seguido por decapitación de ratas recién nacidas. Hemos elegido la decapitación consciente, ya que garantiza la mínima cantidad de tiempo bajo condiciones de hipoxia para el tejido extirpado el corazón / las células. Cantidades relativamente pequeñas de la hipoxia puede conducir a isquemia del miocito y potencialmente la muerte de miocitos, lo cual puede afectar los resultados de este protocolo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Cloruro de potasio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Fosfato sódico dibásico </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> hemostático </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 91308-12 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> pinzas finas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-20 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> grandes tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 91401-14 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> micro-tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 91501-09 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> bisturí manejar </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10008-13 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> hoja de bisturí </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-918-5A </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> Underpad banco absorbente </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> campo estéril </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> autoclave bolsa </td><td> Pescador </td><td> 01-812-54 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> gasa pad </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> betadine </td><td> Purdue Productos </td><td> 67618-150-01 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> guantes estériles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> pipeta de transferencia estéril </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> colagenasa </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Aislamiento </td></tr><tr><td> Teflon varilla 1 / 4 pulgada de diámetro </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Molde de parte </td></tr><tr><td> Teflon ID tubo de 1 / 4 pulgadas, 1 / 2 pulgada OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Molde de parte </td></tr><tr><td> O-Ring de silicona 1 / 4 pulgada ID, 1 / 2 pulgada OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Molde de parte </td></tr><tr><td> Teflon tubo de 1 / 4 de pulgada ID, 5 / 16 pulgadas de diámetro exterior </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Molde de parte </td></tr><tr><td> Kendall jeringas Monoject 6 cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Molde de parte </td></tr><tr><td> BD jeringa de 3 cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Molde de parte </td></tr><tr><td> El fibrinógeno bovino </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Trombina bovina </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 0,2 micrones </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Filtros de 40 micras de células </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 0,45 micras botella superior del filtro </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> vidrio pre-filtro </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 pulgada aguja larga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-5D </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 21G 1 pulgada aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Construir </td></tr><tr><td> la construcción de botes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Medios de comunicación </td></tr><tr><td> suero de caballo </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Medios de comunicación </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Medios de comunicación </td></tr><tr><td> ácido aminocaproico </td><td> Acros orgánicos </td><td> 103305000 </td><td> Medios de comunicación </td></tr><tr><td> de ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Medios de comunicación </td></tr><tr><td> insulina </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Medios de comunicación </td></tr><tr><td> Paraformaldehído, el 16% </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 15710 </td><td> Histología </td></tr><tr><td> La temperatura óptima de corte (OCT) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Histología </td></tr><tr><td> 2-metilbutano </td><td> Pescador </td><td> 03551-4 </td><td> Histología </td></tr><tr><td> Ratón MYH1/2/4/6 anticuerpo primario </td><td> Santa Cruz de Biotecnología </td><td> SC-32732 </td><td> Histología </td></tr><tr><td> Conejo conexina 43 anticuerpo primario </td><td> Señalización Celular Tecnología </td><td> 3512 </td><td> Histología </td></tr><tr><td> DyLight 549-burro conjugado anti-anticuerpo secundario del ratón </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 715-505-151 </td><td> Histología </td></tr><tr><td> DyLight 488-conjugado Donke anticuerpo anti-conejo secundaria </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 711-485-152 </td><td> Histología </td></tr><tr><td> Live / Dead ensayo </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Análisis </td></tr></tbody></table>

encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering

El cultivo de células en un ambiente de hidrogel tridimensional es una técnica importante para el desarrollo de estructuras para la ingeniería de tejidos, así como el estudio de la respuesta celular bajo condiciones de cultivo in vitro diferentes. El entorno de tres dimensiones más se asemeja mucho a lo que las células de observar en vivo debido a la aplicación de estímulos mecánicos y químicos en todas las dimensiones de 1. Tridimensional hidrogeles pueden ser hechas de polímeros sintéticos, tales como el PEG-DA 2 y 3 PLGA o un número de proteínas naturales como el colágeno 4, 5 o ácido hialurónico 6,7 fibrina. Hidrogeles creado a partir de la fibrina, una proteína de la sangre natural de coagulación, puede polimerizar para formar una malla que forma parte de la curación del cuerpo de los procesos naturales de la herida 8. La fibrina es la célula-degradables y potencialmente autólogo 9, por lo que es un ideal andamiaje temporal para la ingeniería de tejidos. A continuación se describe con detalle el aislamiento de los cardiomiocitos neonatales de tres crías de rata día de edad y la preparación de las células para la encapsulación en las construcciones de hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos. Miocitos neonatales son una fuente de células comunes que se utilizan para estudios in vitro en la formación de tejido cardíaco y la ingeniería de 4. Gel de fibrina se crea por el fibrinógeno se mezcla con la enzima trombina. Trombina escinde fibrinopéptidos FPA y FPB de fibrinógeno, revelando los sitios de unión que interactúan con otros monómeros 10. Estas interacciones causa de los monómeros que se auto-ensamblan en las fibras que forman la malla de hidrogel. Debido a que el calendario de esta reacción enzimática se puede ajustar alterando la relación de la trombina de fibrinógeno, o la proporción de calcio a la trombina, se puede moldear por inyección construye con un número de diferentes geometrías 11,12. De otra parte, puede generar la alineación del tejido resultante por la forma en que restringen el gel en la cultura 13. Después de cultivar las construcciones de ingeniería de tejido cardíaco para dos semanas bajo condiciones estáticas, las células cardíacas han comenzado a remodelar la construcción y puede generar una fuerza de contracción en condiciones de estimulación eléctrica 6. Como parte de este protocolo, también se describen los métodos para el análisis de la ingeniería tisular del miocardio después de que el período de cultivo, incluyendo el análisis funcional de la fuerza activa generada por el músculo cardíaco construir sobre la estimulación eléctrica, así como los métodos para la determinación de la viabilidad celular final (en vivo-muerto ensayo) y la tinción inmunohistoquímica para examinar la expresión y la morfología de las proteínas típicas importante para la contracción (cadena pesada de miosina o MHC) y el acoplamiento celular (conexina 43 o Cx43) entre los miocitos.

Watch this Scientific Journal Video about Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering at JoVE.com

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Se describe el aislamiento de los cardiomiocitos neonatales y la preparación de las células para la encapsulación en las construcciones de hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos. Se describen los métodos para el análisis de la ingeniería tisular miocardio después del período de la cultura como fuerza activa generada a la estimulación eléctrica y la viabilidad celular y tinción inmunohistoquímica.

La encapsulación de los cardiomiocitos en un hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Investigación

Bioingeniería

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...