Name: video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s
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Les auteurs tiennent à remercier pour leur soutien Thorlabs de ce projet. AJN tient à souligner le soutien d&#39;une bourse de la NSF supérieures. Ce travail a été partiellement financé par le National Institutes of Health à travers le directeur des NIH Programme Innovateur nouveau prix, le numéro de subvention de 1 DP2 OD007096-01. Renseignements sur le Programme Innovator Award est à New <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Les auteurs tiennent à remercier Tom Hayes pour l&#39;utilisation du laboratoire de Harvard Electronics.

<ol>
	<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 985-985 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li><li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics.">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li><li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging.">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li><li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration.">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation.">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li><li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+(Cell-viZio)+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation.">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li><li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+confocal+laser+endomicroscopy.">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li><li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy.">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li><li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li></ol>

La production de ce vidéo-cette vidéo a été parrainé par Thorlabs, Inc

Ce système d&#39;imagerie vidéo-taux fait usage d&#39;une exploitation miroir galvanométrique de résonance à environ 8 kHz. Miroirs résonance peut être assez fort quand il est lancé à pleine puissance, et leur hauteur élevée peut être gênant ou même dangereux à certains moments une exposition suffisante. Bien que n&#39;étant pas démontré ici, il est recommandé de protéger le miroir galvanométrique de résonance dans un boîtier transparent pour réduire considérablement le volume du système et / ou de porter des vêtements de protection appropriés auditive, comme des bouchons. Le miroir galvanométrique résonance scans dans un modèle sinusoïdal. Toutefois, les cartes framegrabber lire dans le signal en supposant une vitesse de balayage complètement linéaire dans les deux directions horizontale et verticale. Depuis un balayage sinusoïdal ralentit sur les bords de la numérisation, les artefacts de compression d&#39;image peuvent être observés le long de l&#39;axe d&#39;image (horizontale) rapide. Une façon de minimiser ce problème est de volontairement disque de la gamme de résonance galvo numérisation miroir significativement plus grande que ladiamètre de la lentille de relais. En faisant cela, que le balayage presque linéaire centrale du motif de balayage sinusoïdal va traverser l&#39;échantillon, ce qui minimise les distorsions de l&#39;image. Une autre approche serait de post-traitement des images recueillies pour linéariser l&#39;axe rapide. Ceci peut être accompli par imagerie par fluorescence un modèle connu (comme une grille) et en utilisant les dimensions de la forme connue de créer un script de traitement qui unwarps les images recueillies. Ce système de balayage particulier a été conçu dans le but de l&#39;imagerie in vivo, ce qui nécessite souvent une verticale orientée vidéo-taux microscope. Pour des expériences d&#39;imagerie cellulaire, microscopes inversés sont plus généralement utilisés. La conception présentées ici peuvent être facilement modifiées pour construire un tel microscope inversé, tout ce qui est requis est une rotation de la finale 2 miroirs &quot;de diamètre. Au lieu d&#39;orienter le miroir pour diriger le faisceau de balayage à la baisse, le miroir peut diriger le faisceau vers le haut. Placer la lentille de l&#39;objectif d&#39;unt à la même distance du miroir avec une étape de l&#39;échantillon permettrait d&#39;imagerie dans une géométrie inversée. Si le système d&#39;imagerie est construit exclusivement pour l&#39;imagerie microendoscopic, il n&#39;ya pas de raison de «plier» la conception de microscope verticalement à tous. Au lieu de cela, le système de balayage complet peut être construit sur une planche à pain horizontale simple avec le parallèle objectif orienté vers la table d&#39;optique. Notez que le microscope dans cette version utilise une configuration sténopé fixes, tandis que la présente offre pour la plus grande simplicité et facilité la construction de l&#39;alignement, les utilisateurs désirant un système plus polyvalent pourrait envisager d&#39;intégrer un sténopé variable, comme on peut le trouver dans la plupart des microscopes confocaux commerciales. En permettant à l&#39;utilisateur d&#39;ajuster la taille du sténopé pour compenser pour les échantillons d&#39;intensité variable d&#39;émission, ce qui permet à l&#39;utilisateur de mieux optimiser le compromis entre la puissance du signal et de résolution pour un échantillon donné. Le CHoix de la fibre de l&#39;image sélectionnée pour le microscope est important. Nous vous recommandons d&#39;utiliser des fibres Sumitomo image cohérente en raison de leur espacement coeur de la fibre à proximité et à faible autofluorescence relative. Fibres d&#39;images fabriquées par Fujikura ont été trouvés à avoir des quantités élevées de l&#39;autofluorescence 10, qui peut submerger faibles signaux de fluorescence d&#39;un échantillon et de limiter la sensibilité ultime de l&#39;microendoscope. Sumitomo fibres fabriquées, comme le 8-30N utilisé dans cette configuration particulière, ont beaucoup plus bas niveaux de l&#39;autofluorescence que leurs équivalents Fujikura. Alors que les faisceaux de fibres lessivé pourrait être considéré comme attractif pour microendoscopy, leur conception des lieux généralement noyaux de fibres individuelles trop éloignés, ce qui signifie que les noyaux des fibres des exemples d&#39;objets à faible densité, en laissant de côté les régions importantes d&#39;intérêt potentiel. Enfin, il convient de noter que bien que le microscope décrites ici seront utiles dans une variété de techniques in vitro et in vivo applications et peuvent être créés pour une fraction du coût d&#39;un système complet de commerce, il n&#39;a pas de caractéristiques telles que la détection de lumière transmise, un oculaire pour la visualisation, ou un parcours du faisceau pour les non-confocale à champ large épifluorescence. Bien qu&#39;il soit possible de construire un système avec ces caractéristiques à partir de zéro, les lecteurs désirant un tel système peut souhaiter modifier un système commercial existant pour répondre à leurs besoins plutôt que d&#39;initier une toute nouvelle construction.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de la pièce </td><td> Fabricant </td><td> Numéro de l&#39;article </td><td> Spécifications </td><td> Quantité </td></tr><tr><td> 515 Filtre passe-bande nm </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatique lentille doublet 25.4mm Dia. FL x 50mm, revêtement MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatique lentille doublet 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, revêtement MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatique lentille doublet 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, revêtement MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Achromatique Dia lentille doublet 50mm. FL x 300mm, revêtement MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 R kHz Fréquence scanner optique haute </td><td> Électro-optique Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Pilote AGC </td><td> Électro-optique Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA module photocapteur </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Limitation de courant recommandée </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Alimentation </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Pour une utilisation avec H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO Objectif CS </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Carte Solios framegrabber eA / XA </td><td> Matrox </td><td> Solios eA / XA </td><td> MIL logiciels nécessaires; OEM interconnexions recommandée </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Alimentation 12V </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5x objectif de microscope </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, Longueur focale 25,4 mm </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fibre image cohérente </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;Vis -20 et kit matériel </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 um Gendarmerie sténopé </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td> Idéal pour la construction de filtres spatiaux </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Pince Cube Cage </td><td> Thorlabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Cube Système Cage, 4-Way </td><td> Thorlabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B du code PIN, Fibre SM Diode Laser queue de cochon, FC / PC </td><td> Thorlabs </td><td> LPS-406-CF </td><td> Produit obsolète; remplacé par LP405-SF10 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5-Minute Epoxy, une once </td><td> Thorlabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 Axe cinématique optique mont </td><td> Thorlabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Vis et Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Vis sans tête et Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adaptateur avec Threads RMS externes et internes Threads SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. FC / PC et FC / APC collimateur, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> Thorlabs </td><td> CFC-2X-A </td><td> f = 2,0 mm </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adaptateur réglable Collimateur fibre, SM1 fileté </td><td> Thorlabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Aluminium Breadboard, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 fileté </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Benchtop Diode Laser / TEC Contrôleur </td><td> Thorlabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm de long-Pass miroir dichroïque </td><td> Thorlabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Cinématique de montage pour Ø1 &quot;Optique </td><td> Thorlabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC de montage pour Diodes laser à fibre Thorlabs queue de cochon </td><td> Thorlabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monture pour Ø18 mm Optique </td><td> Thorlabs </td><td> LMR18 </td><td> Un anneau de retenue inclus </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montures Lens 2 &quot;Optique </td><td> Thorlabs </td><td> LMR2S </td><td> Avec filetage intérieur et extérieur; l&#39;anneau de retenue inclus </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Série Cage Assemblée Rod, 6 &quot;de long, ø4 mm, Quantité 1. </td><td> Thorlabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Post pilier piédestal, 8-32 Taps, une« longue </td><td> Thorlabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Post Extension pilier, Longueur = 0,5 </td><td> Thorlabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Post Extension pilier, Longueur = 0,75&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;protégées Silver Mirror, 3,2 mm d&#39;épaisseur </td><td> Thorlabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 élément rotatif réglable focalisation, L = 1&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;protégées Silver Mirror, 3,2 mm d&#39;épaisseur </td><td> Thorlabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 um Gendarmerie sténopé </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris faible dérive Ø1 &quot;cinématique miroir mont </td><td> Thorlabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Faible dérive </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 lentille de tube, L = 1 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Un anneau de retenue inclus </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 fileté 30 mm Plaque Cage, 0,35 &quot;d&#39;épaisseur </td><td> Thorlabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 à M25 Adaptateur composants optiques Threading </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A24 </td><td> Externe et interne Threads SM1 M25.5x0.5 Threads </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Diam petit faisceauETER galvanométrique système </td><td> Thorlabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Petite Fourche de serrage </td><td> Thorlabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;lamés slot, universel </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Système spatial de filtre </td><td> Thorlabs </td><td> KT310 </td><td> Sténopé vendu séparément </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-refroidis de montage pour 5,6 mm et 9 Lasers </td><td> Thorlabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Support vertical pour les cartes sans </td><td> Thorlabs </td><td> VB01 </td><td> Chaque </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

La microscopie confocale est devenu un outil précieux dans la biologie et les sciences biomédicales, permettant rapide, haute sensibilité, haute résolution et sectionnement optique de systèmes complexes. La microscopie confocale est couramment utilisé, par exemple, pour étudier des cibles cellulaires spécifiques 1, la dynamique de moniteur dans des cellules vivantes 2-4, et de visualiser l&#39;évolution en trois dimensions de l&#39;ensemble des organismes 5,6. Extensions de systèmes d&#39;imagerie confocale, comme microendoscopes confocal, permettant l&#39;imagerie haute résolution in vivo 7 et sont actuellement appliquées à l&#39;imagerie et le diagnostic des maladies dans les milieux cliniques 8,9. La microscopie confocale permet la résolution en trois dimensions en créant soi-disant «sections optiques» en utilisant l&#39;optique géométrique simple. Dans un standard à grand champ de microscope, fluorescence générée à partir d&#39;un échantillon est prélevé par une lentille de l&#39;objectif et relayés directement à un détecteur. Alors que d&#39;acceptermesure pour des échantillons d&#39;imagerie fine, des échantillons d&#39;épaisseur deviennent floues générées par fluorescence au-dessus et ci-dessous le plan objectif focale. En revanche, la microscopie confocale permet virtuel, sectionnement optique des échantillons, en rejetant hors de focaliser la lumière pour construire une haute résolution en trois dimensions des représentations d&#39;échantillons. Microscopes confocaux réaliser cet exploit en utilisant une ouverture confocale dans le faisceau de détection. La fluorescence recueillies auprès d&#39;un échantillon par l&#39;objectif est relayée à travers les miroirs de balayage et à travers le miroir primaire dichroïque, un miroir soigneusement choisis pour refléter les courtes longueurs d&#39;onde tels que le faisceau d&#39;excitation laser en passant plus la, Stokes décalée d&#39;émission de fluorescence. Ce signal longueur d&#39;onde de fluorescence est ensuite transmis à une paire de lentilles de chaque côté d&#39;un trou d&#39;épingle qui est positionnée à un plan exactement conjugué avec le plan focal de l&#39;objectif. Photons collectés à partir du volume focal de l&#39;objet sont collimatéspar l&#39;objectif et sont focalisés par des lentilles confocale à travers le sténopé. Fluorescence généré au-dessus ou en dessous du plan focal ne seront donc pas collimaté correctement, et ne passera pas à travers le sténopé confocal à 1, la création d&#39;une section optique dans laquelle seule la lumière de l&#39;accent microscope est visible. (Fig 1). Ainsi, le sténopé agit efficacement comme une ouverture virtuelle dans le plan focal, confinant l&#39;émission détectée à une seule localisation spatiale limitée. Commerciale moderne microscopes confocaux offrir aux utilisateurs un fonctionnement entièrement automatisé, ce qui rend les procédures d&#39;imagerie anciennement complexes relativement simple et accessible. Malgré la souplesse et la puissance de ces systèmes, commerciaux microscopes confocaux sont pas bien adaptés pour toutes les tâches d&#39;imagerie confocale, comme de nombreuses applications d&#39;imagerie in vivo. Sans la possibilité de créer des systèmes d&#39;imagerie personnalisé pour répondre à leurs besoins, des expériences importantes peuvent rester hors de réactionsh pour de nombreux scientifiques. Dans cet article, nous proposons une méthode étape par étape pour la construction complète d&#39;une coutume, la vidéo à taux système d&#39;imagerie confocale à partir de composants de base. Le microscope droit sera construit en utilisant un miroir galvanométrique de résonance pour fournir l&#39;axe de balayage rapide, tandis qu&#39;une vitesse standard de résonance miroir galvanométrique va scanner l&#39;axe lent. Pour créer un faisceau bien précis numérisés dans la mise au point objectif, ces miroirs sera positionné à l&#39;avion que l&#39;on appelle l&#39;aide de quatre lentilles télécentriques relais. La détection confocale sera accompli en utilisant un standard, tube photomultiplicateur off-the-shelf (PMT), et les images seront capturées et affichées en utilisant une carte Matrox framegrabber et le logiciel inclus.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

La construction complète d&#39;une coutume, en temps réel du système d&#39;imagerie confocale à balayage est décrite. Ce système, qui peut être facilement utilisé pour la vidéo-microscopie et taux de microendoscopy, permet une gamme de géométries d&#39;imagerie et les applications ne sont pas accessibles à l&#39;aide de systèmes commerciaux standard confocale, à une fraction du coût.

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