Name: video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy at JoVE.com

लेखकों के लिए इस परियोजना के अपने समर्थन के लिए Thorlabs धन्यवाद करना चाहते हैं. AJN के लिए एक NSF ग्रेजुएट फैलोशिप के समर्थन को स्वीकार करना चाहती है. इस काम आंशिक रूप से एनआईएच के निदेशक की नई अन्वेषक पुरस्कार कार्यक्रम के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, अनुदान संख्या 1 OD007096 01 DP2 द्वारा वित्त पोषित किया गया था. नई अन्वेषक पुरस्कार कार्यक्रम पर सूचना पर <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . लेखकों हार्वर्ड इलेक्ट्रॉनिक्स प्रयोगशाला के उपयोग के लिए टॉम Hayes धन्यवाद देना चाहूंगा.

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इस वीडियो इस वीडियो का उत्पादन Thorlabs इंक द्वारा प्रायोजित किया गया था

इस वीडियो दर इमेजिंग प्रणाली एक गुंजयमान galvanometric दर्पण के संचालन के बारे में 8 kHz पर उपयोग करता है. गूंजनेवाला दर्पण काफी जोर हो सकता है जब पूर्ण सत्ता में संचालित कर सकते हैं, और उनके उच्च पिच कष्टप्रद या भी खतरनाक पर्याप्त जोखिम बार किया जा सकता है. हालांकि यहां से प्रदर्शन नहीं, यह एक पारदर्शी मामले के अंदर गुंजयमान galvanometric दर्पण ढाल प्रणाली मात्रा और / या earplugs जैसे उचित सुनवाई सुरक्षात्मक गियर, पहनने के लिए काफी कम की सिफारिश की है. गुंजयमान galvanometric दर्पण एक sinusoidal पैटर्न में स्कैन. हालांकि, framegrabber कार्ड संकेत दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशा में एक पूरी तरह से रैखिक झाडू दर संभालने में पढ़ें. चूंकि एक sinusoidal स्वीप स्कैन के किनारों पर धीमा, छवि सम्पीडन कलाकृतियों तेजी से छवि (क्षैतिज) अक्ष के साथ मनाया जा सकता है. एक ही रास्ता के लिए इस समस्या को कम करने के लिए जानबूझकर गुंजयमान galvo दर्पण स्कैनिंग रेंज ड्राइव है, काफी से बड़ारिले लेंस व्यास. ऐसा करने में, केवल लगभग रेखीय sinusoidal स्कैन पैटर्न के केंद्रीय झाडू नमूना पार, छवि विकृतियों को कम करेगा. एक और दृष्टिकोण प्रक्रिया के बाद एकत्र की छवियों को तेजी से धुरी linearize. इस इमेजिंग द्वारा पूरा किया जा सकता है एक ज्ञात फ्लोरोसेंट पैटर्न (जैसे कि एक ग्रिड के रूप में) और ज्ञात पैटर्न आयामों का उपयोग करने के लिए एक प्रसंस्करण स्क्रिप्ट है कि एकत्र की छवियों unwarps बना. यह विशेष रूप से स्कैनिंग सिस्टम vivo इमेजिंग, जो अक्सर एक ईमानदार उन्मुख वीडियो दर खुर्दबीन की आवश्यकता के प्रयोजन के लिए डिजाइन किया गया था . सेलुलर इमेजिंग प्रयोगों के लिए, उलटा माइक्रोस्कोप अधिक आम तौर पर उपयोग किया जाता है. यहाँ प्रस्तुत डिजाइन आसानी से हो सकता है इस तरह के एक उलटा माइक्रोस्कोप बनाने बदला जा सकता है, सभी आवश्यक है कि अंतिम 2 &quot;व्यास दर्पण के एक रोटेशन है. दर्पण orienting स्कैनिंग बीम के नीचे सीधे के बजाय, दर्पण बीम ऊपर प्रत्यक्ष कर सकते हैं. उद्देश्य लेंस एक रखकरएक नमूना मंच के साथ साथ दर्पण से एक ही दूरी टी इमेजिंग के लिए एक औंधा ज्यामिति में अनुमति होगी. यदि इमेजिंग प्रणाली microendoscopic इमेजिंग के लिए किया जा रहा है पूरी तरह से बनाया, वहाँ कोई कारण माइक्रोस्कोप डिजाइन खड़ी सब पर &quot;गुना&quot; नहीं है. इसके बजाय, संपूर्ण प्रणाली स्कैनिंग उद्देश्य लेंस ऑप्टिकल तालिका करने के लिए उन्मुख समानांतर के साथ एक एकल क्षैतिज breadboard पर बनाया जा सकता है है. ध्यान दें कि इस निर्माण में खुर्दबीन एक निश्चित pinhole विन्यास का उपयोग करता है, जबकि यह सबसे बड़ी निर्माण सादगी और संरेखण में आसानी के लिए प्रदान करता है, एक और अधिक बहुमुखी प्रणाली इच्छा उपयोगकर्ताओं को एक चर pinhole शामिल करने पर विचार के रूप में सबसे वाणिज्यिक confocal सूक्ष्मदर्शी में पाया जा सकता है है हो सकता है. उपयोगकर्ता उत्सर्जन तीव्रता बदलती के नमूने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए pinhole के आकार को समायोजित करने के लिए अनुमति करके, इस उपयोगकर्ता किसी दिए गए नमूने के लिए बेहतर करने के लिए सिग्नल की शक्ति और संकल्प के बीच tradeoff अनुकूलन की अनुमति देता है. चर्चामाइक्रोस्कोप के लिए चयनित छवि फाइबर के oice महत्वपूर्ण है. हम सुमितोमो सुसंगत छवि उनके करीबी फाइबर कोर रिक्ति और कम रिश्तेदार autofluorescence कारण फाइबर का उपयोग करने की सलाह देते हैं. छवि Fujikura द्वारा निर्मित फाइबर autofluorescence 10 की उच्च मात्रा है, जो एक नमूना से कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत डूब और microendoscope के परम संवेदनशीलता को सीमित कर सकते हैं पाया गया है. सुमितोमो जैसे इस विशेष सेटअप में प्रयुक्त 8-30N निर्मित फाइबर, उनके Fujikura समकक्ष की तुलना में बहुत कम autofluorescence स्तर है. जबकि leeched फाइबर बंडलों microendoscopy के लिए आकर्षक माना जा सकता है, उनके डिजाइन आमतौर पर व्यक्तिगत फाइबर कोर बहुत दूर स्थानों, जिसका अर्थ है कि फाइबर कम नमूना वस्तुओं कोर बाहर संभावित हित के महत्वपूर्ण क्षेत्रों को छोड़कर. अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब खुर्दबीन यहाँ वर्णित की एक किस्म में इन विट्रो में और vivo applicati में उपयोगी हो जाएगा चाहिएons और एक पूर्ण विशेषताओं वाणिज्यिक प्रणाली की लागत के एक अंश के लिए बनाया जा सकता है है, यह संचारित प्रकाश का पता लगाने, देखने के लिए एक ऐपिस या गैर confocal widefield epifluorescence के लिए एक किरण पथ के रूप में सुविधाओं नहीं है. हालांकि यह संभव है खरोंच से इन सुविधाओं के साथ एक प्रणाली का निर्माण करने के लिए, एक ऐसी प्रणाली इच्छा पाठकों के लिए एक मौजूदा वाणिज्यिक उनकी जरूरतों को पूरा करने के बजाय एक पूरी तरह से नए निर्माण आरंभ प्रणाली को संशोधित करने की इच्छा हो सकती है.

<table border="1"><tbody><tr><td> पार्ट नाम </td><td> निर्माता </td><td> आइटम नंबर </td><td> निर्दिष्टीकरण </td><td> मात्रा </td></tr><tr><td> 515 एनएम बैंड पास फ़िल्टर </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> अवर्णी नक़ल लेंस 25.4mm व्यास. x 50mm FL, MgF2 कोटिंग </td><td> एडमंड प्रकाशिकी </td><td> NT49 - 766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> अवर्णी नक़ल लेंस 25.4mm व्यास. x 76.2mm FL, MgF2 कोटिंग </td><td> एडमंड प्रकाशिकी </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> अवर्णी नक़ल लेंस 25.4mm व्यास. x 88.9mm FL, MgF2 कोटिंग </td><td> एडमंड प्रकाशिकी </td><td> NT49 - 769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> अवर्णी नक़ल लेंस 50mm व्यास. x 300mm FL, MgF2 कोटिंग </td><td> एडमंड प्रकाशिकी </td><td> NT45 - 179 </tघ&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz आर उच्च आवृत्ति ऑप्टिकल स्कैनर </td><td> इलेक्ट्रो ऑप्टिकल उत्पाद निगम (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGC चालक </td><td> इलेक्ट्रो ऑप्टिकल उत्पाद निगम (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422 - पीए Photosensor मॉड्यूल </td><td> हामामत्सु </td><td> H7422-PA </td><td> वर्तमान सिफारिश सीमित </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 विद्युत की आपूर्ति </td><td> हामामत्सु </td><td> M9012 </td><td> H7422 - पीए के साथ उपयोग के लिए </td><td> 1 </td></tr><tr><td> कोर्ट पीएल APO सीएस उद्देश्य </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios Framegrabber / EA XA कार्ड </td><td> Matrox </td><td> Solios EA / XA </td><td> मिल सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है, OEM interconnects की सिफारिश की </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 12V विद्युत आपूर्ति </td><tघ&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> 12 वी, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5x माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस </td><td> न्यूपोर्ट </td><td> M-5X </td><td> एनए 0.10, 25.4 मिमी नाभीय लंबाई </td><td> 1 </td></tr><tr><td> सुसंगत छवि फाइबर </td><td> सुमितोमो </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 कैप भाड़ और हार्डवेयर किट </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 सुक्ष्ममापी Pinhole घुड़सवार </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td> स्थानिक फिल्टर के निर्माण के लिए आदर्श </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 मिमी केज घन दबाना </td><td> Thorlabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 मिमी केज सिस्टम घन, 4-Way </td><td> Thorlabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 एनएम, 5 मेगावाट, बी पिन कोड, एस.एम. फाइबर Pigtailed लेजर डायोड, एफसी पीसी / </td><td> Thorlabs </td><td> एलPS-406-एफसी </td><td> अप्रचलित उत्पाद, LP405-SF10 द्वारा प्रतिस्थापित </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 मिनट Epoxy, एक औंस </td><td> Thorlabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 ऐक्सिस विज्ञान सम्बन्धी ऑप्टिक माउंट </td><td> Thorlabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 कैप भाड़ और हार्डवेयर किट </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Setscrew और हार्डवेयर किट </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> बाहरी आरएमएस धागे और आंतरिक SM1 धागे के साथ एडाप्टर </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. एफसी / पीसी और एफसी / APC Collimator, च = 2.0 मिमी, एआरसी: 400-600 एनएम </td><td> Thorlabs </td><td> सीएफसी 2X-A </td><td> च = 2.0 मिमी </td><td> 1 </td></tr><tr><td> समायोज्य फाइबर Collimator एडाप्टर, लड़ी पिरोया SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> एल्यूमिनियम breadboard, 12 &quot;x 18&quot; एक्स 1 / 2 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 लड़ी पिरोया </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Benchtop लेजर डायोड / टीईसी नियंत्रक </td><td> Thorlabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 डब्ल्यू </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 एनएम लंबे दर्रा Dichroic मिरर </td><td> Thorlabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1 &quot;प्रकाशिकी के लिए विज्ञान सम्बन्धी माउंट </td><td> Thorlabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> / LD TEC Thorlabs फाइबर Pigtailed लेजर डायोड के लिए माउंट </td><td> Thorlabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø18 मिमी प्रकाशिकी के लिए लेंस माउंट </td><td> Thorlabs </td><td> LMR18 </td><td> एक को बनाए रखना अंगूठी </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 &quot;प्रकाशिकी के लिए लेंस Mounts </td><td> Thorlabs </td><td> LMR2S </td><td> साथ आंतरिक और बाह्य सूत्रण, अनुचर की अंगूठी </td><td> 2 </td></tr><tr><td> मिनी श्रृंखला पिंजरे विधानसभा रॉड, 6 &quot;लम्बी, Ø4 मिमी, मात्रा 1. </td><td> Thorlabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;कुरसी स्तंभ डाक, 8-32 नल, 1&quot; लंबे समय से </td><td> Thorlabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1 &quot;स्तंभ डाक एक्सटेंशन की लंबाई, = 0.5 </td><td> Thorlabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1 &quot;स्तंभ डाक एक्सटेंशन, लंबाई 0.75 =&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1 &quot;संरक्षित रजत मिरर, 3.2 मिमी मोटी </td><td> Thorlabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1 &quot;SM1 घूर्णन समायोज्य केंद्रित तत्व, एल = 1&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1V10 </tघ&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O2 &quot;संरक्षित रजत मिरर, 3.2 मिमी मोटी </td><td> Thorlabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 सुक्ष्ममापी घुड़सवार Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> पोलारिस कम बहाव O1 &quot;विज्ञान सम्बन्धी आईना माउंट </td><td> Thorlabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> कम बहाव </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 लेंस ट्यूब, = ​​एल 1 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1L - 10 </td><td> एक को बनाए रखना अंगूठी </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 लड़ी पिरोया 30 मिमी केज प्लेट, 0.35 &quot;मोटा </td><td> Thorlabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 के लिए M25 ऑप्टिकल घटक सूत्रण अडैप्टर </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A24 </td><td> बाहरी SM1 धागे और आंतरिक M25.5x0.5 धागे </td><td> 1 </td></tr><tr><td> लघु बीम diameter galvo सिस्टम </td><td> Thorlabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> छोटा Clamping कांटा </td><td> Thorlabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;स्लॉट counterbored, सार्वभौमिक </td><td> 15 </td></tr><tr><td> स्थानिक फ़िल्टर प्रणाली </td><td> Thorlabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole अलग से बेचा </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5.6 और 9 मिमी लेजर के लिए ते कूल्ड माउंट </td><td> Thorlabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Breadboards के लिए कार्यक्षेत्र ब्रैकेट </td><td> Thorlabs </td><td> VB01 </td><td> प्रत्येक </td><td> 2 </td></tr><tr><td> योजना - Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

एक कस्टम वास्तविक समय confocal स्कैनिंग इमेजिंग प्रणाली के पूर्ण निर्माण में वर्णित है. इस प्रणाली है, जो आसानी से वीडियो दर माइक्रोस्कोपी और microendoscopy के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इमेजिंग geometries और अनुप्रयोगों सुलभ नहीं लागत के एक अंश पर मानक वाणिज्यिक confocal सिस्टम का उपयोग कर के एक सरणी के लिए अनुमति देता है.

वीडियो दर स्कैन Confocal माइक्रोस्कोपी और Microendoscopy

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