Name: video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer pelo seu apoio ThorLabs deste projeto. AJN gostaria de agradecer o apoio de uma Pós-Graduação NSF Fellowship. Este trabalho foi parcialmente financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde através do Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award, conceder número 1 DP2 OD007096-01. Informações sobre o Programa New Innovator Award está em <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Os autores gostariam de agradecer a Tom Hayes para a utilização do laboratório de Eletrônica Harvard.

<ol>
	<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 985-985 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li><li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics.">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li><li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging.">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li><li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration.">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation.">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li><li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+(Cell-viZio)+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation.">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li><li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+confocal+laser+endomicroscopy.">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li><li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy.">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li><li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li></ol>

Produção deste video video-este era patrocinado pela Thorlabs, Inc.

Este sistema de imagem de vídeo-rate faz uso de um espelho ressonante galvanométricos operacional em cerca de 8 kHz. Espelhos de ressonância pode ser bastante alto quando trabalhar a plena potência, e seu tom alto pode ser incômodo ou até mesmo perigoso em tempos de exposição suficiente. Apesar de não demonstrado aqui, é recomendado para proteger o espelho ressonante galvanométricos dentro de uma caixa transparente de reduzir significativamente o volume do sistema e / ou para usar equipamentos adequados de proteção auditiva, como tampões de ouvido. O espelho de ressonância galvanométricos scans em um padrão sinusoidal. No entanto, os cartões framegrabber lido em sinal assumindo uma velocidade de varredura completamente linear em ambas as direções horizontal e vertical. Desde uma varredura senoidal desacelera nas bordas da digitalização, os artefatos de compressão de imagem pode ser observada ao longo do eixo de imagem rápido (horizontal). Uma forma de minimizar este problema é propositadamente conduzir o ressonante Galvo faixa de varredura espelho significativamente maior do que odiâmetro da lente relay. Ao fazer isso, apenas varrer o quase linear central do padrão de leitura sinusoidal irá percorrer a amostra, minimizando distorções de imagem. Outra abordagem seria de pós-processamento de imagens coletadas para linearizar o eixo rápido. Isso pode ser feito por imagem um padrão conhecido fluorescentes (como uma grade) e usando as dimensões padrão conhecido para criar um script de processamento que unwarps as imagens coletadas. Este sistema de digitalização especial foi projetado com a finalidade de imagem in vivo, que muitas vezes exige uma posição vertical orientada microscópio de vídeo-rate. Para experimentos com imagens de celular, microscópios invertidos são mais tipicamente usado. O projeto aqui apresentado pode ser facilmente alterada para construir tal um microscópio invertido, tudo que é necessário é uma rotação da final espelho de diâmetro 2 &quot;. Em vez de orientar o espelho para direcionar o feixe de varredura para baixo, o espelho pode direcionar o feixe para cima. Colocar a lente objetiva umat a mesma distância do espelho, juntamente com um estágio de amostra permitiria imagem em uma geometria invertida. Se o sistema de imagem está sendo construída unicamente para imagens microendoscópica, não há razão para &quot;dobrar&quot; o projeto microscópio verticalmente em tudo. Em vez disso, o sistema de digitalização inteira pode ser construída sobre uma placa de montagem horizontal único com o paralelo lente objetiva orientada para a mesa óptica. Note-se que o microscópio nesta compilação usa uma configuração fixa pinhole, enquanto este prevê a maior simplicidade e facilidade de construir o alinhamento, os usuários que desejam um sistema mais versátil pode considerar a incorporação de uma pinhole variável, como pode ser encontrado na maioria dos comerciais microscópios confocal. Ao permitir que o usuário ajuste o tamanho da pinhole para compensar as amostras de diferentes intensidade de emissão, isto permite que o usuário para melhor otimizar o equilíbrio entre a força do sinal ea resolução de uma dada amostra. O choice de fibra de imagem selecionada para o microscópio é importante. Recomendamos o uso de fibras imagem Sumitomo coerente devido ao seu afastamento do núcleo de fibra perto e autofluorescência relativamente baixo. Fibras de imagem fabricado pela Fujikura foram encontrados para ter grandes quantidades de autofluorescência 10, que pode sobrecarregar fracos sinais de fluorescência de uma amostra e limitar a sensibilidade final do microendoscope. Sumitomo fibras fabricadas, como o 8-30N utilizado nesta configuração particular, têm muito mais baixos níveis de autofluorescência do que seus equivalentes Fujikura. Enquanto feixes de fibras leeched pode ser considerado atraente para microendoscopy, o seu design tipicamente lugares núcleos de fibra individuais muito longe, o que significa que os núcleos de fibra objetos pouco de amostra, deixando de fora as regiões significativas de interesse potencial. Finalmente, deve-se notar que, enquanto o microscópio descrito aqui será útil em uma variedade de in vitro e in vivo applications e pode ser criado por uma fração do custo de um sistema full-featured comercial, ele não tem recursos como detecção de luz transmitida, uma ocular para a visão, ou um caminho do feixe para não-confocal campo amplo de epifluorescência. Embora seja possível construir um sistema com estas características a partir do zero, os leitores que desejam um sistema deste tipo pode desejar modificar um sistema comercial existente para atender suas necessidades ao invés de dar início a uma inteiramente nova construção.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome da parte </td><td> Fabricante </td><td> Número do Item </td><td> Especificações </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> 515 nm filtro passa-banda </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Doublet Lens Dia 25,4 milímetros. FL x 50mm, revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Doublet Lens Dia 25,4 milímetros. FL x 76,2 mm, revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Doublet Lens Dia 25,4 milímetros. x 88,9 milímetros FL, Revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Dia Lente acromática Doublet 50mm. FL x 300mm, revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz R Scanner óptico de alta freqüência </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Driver de AGC </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA Módulo Fotosensor </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Limitação de corrente recomendada </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Alimentação </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Para uso com H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS Objetivo </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios Cartão Framegrabber eA / XA </td><td> Matrox </td><td> Solios eA / XA </td><td> MIL software necessário; OEM interliga recomendado </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fonte de alimentação 12V </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lente objetiva de 5x Microscópio </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, Comprimento 25,4 milímetros Focal </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fibra imagem coerente </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;Parafuso -20 e Kit Hardware </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 mm Montado Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td> Ideal para a construção de filtros espaciais </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 milímetros Grampo Cube Gaiola </td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 milímetros Cube Sistema Cage, 4-Way </td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B Pin Code, fibra SM Diode Laser Pigtailed, FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Produtos obsoletos; substituído por LP405-SF10 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 Minute-Epoxy, uma onça </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 Axis cinemática Optic Monte </td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Parafuso e Kit Hardware </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Parafuso de fixação 8-32 e Kit Hardware </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adaptador com Rosca externa RMS e roscas internas SM1 </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. FC / PC e FC / APC Collimator, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> ThorLabs </td><td> CFC-A-2X </td><td> f = 2,0 milímetros </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adaptador Colimador ajustável Fibra, SM1 Threaded </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Breadboard de alumínio, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 Threaded </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Diode Laser de bancada / TEC Controlador </td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm Espelho longa-Pass Dichroic </td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monte cinemática para Ø1 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC montagem para Diodos ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser </td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montagem de Lente de Ø18 MM Optics </td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td> Um anel de retenção incluído </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montagem da lente para 2 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td> Com internos e externos threading; anel de fixação incluída </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Series Gaiola Assembléia Rod, 6 &quot;mm, Long Ø4, Quantidade 1. </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Post Pillar Pedestal, 8-32 Taps, um&quot; Long </td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pilar Mensagem Extensão Comprimento, = 0,5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pilar Mensagem Extensão Comprimento, = 0,75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protected Prata Espelho, 3,2 mm de espessura </td><td> ThorLabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 rotação do elemento ajustável foco, L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;Protected Prata Espelho, 3,2 mm de espessura </td><td> ThorLabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 mM Mounted Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris Deriva Low Ø1 &quot;cinemática Espelho Monte </td><td> ThorLabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Drift baixo </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 Lens Tube, L = 1 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Um anel de retenção incluído </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 Threaded 30 Placa Gaiola mm, 0,35 &quot;Thick </td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 a M25 Adaptador Componente Óptico de Threading </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td> Externa e interna Threads SM1 M25.5x0.5 Tópicos </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Diam Boca pequenaeter Galvo Sistema </td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fork aperto pequena </td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 25/01 &quot;escareados slot, universal </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Sistema de filtro espacial </td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole vendido separadamente </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-Cooled montagem para 5,6 e 9 milímetros Lasers </td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Suporte Vertical para Breadboards </td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td> Cada </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano Apochromat- </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

Microscopia confocal tem se tornado uma ferramenta valiosa na biologia e nas ciências biomédicas, permitindo rápido, de alta sensibilidade e alta resolução de seccionamento óptico de sistemas complexos. Microscopia confocal é rotineiramente usado, por exemplo, para estudar alvos celulares específicos 1, monitor dinâmica em células vivas 2-4, e visualizar a evolução tridimensional de organismos inteiros 5,6. Extensões de sistemas de imagem confocal, como microendoscopes confocal, permitem alta resolução de imagem in vivo 7 e estão actualmente a ser aplicado a imagem da doença e diagnóstico em clínicas 8,9. Microscopia confocal tridimensional fornece resolução criando os chamados &quot;seções óptica&quot; utilizando óptica geométrica simples. Em um microscópio de campo amplo padrão, de fluorescência gerada a partir de uma amostra é coletada por uma lente objetiva e retransmitidas diretamente para um detector. Enquanto aceitarcapaz de amostras de imagem fina, as amostras de espessura embaçada por fluorescência gerada acima e abaixo do plano objetivo focal. Em contraste, microscopia confocal permite corte, virtual óptico de amostras, rejeitando out-of-foco de luz para construir de alta resolução representações tridimensionais de amostras. Microscópios confocal a conseguir este feito através de uma abertura confocal no caminho do feixe de detecção. A fluorescência de uma amostra coletada pelo objectivo é retransmitida de volta através dos espelhos de varredura e através do espelho primário dicróicas, um espelho para refletir cuidadosamente selecionados comprimentos de onda mais curtos, como o feixe de laser de excitação durante a passagem do tempo, Stokes-shifted emissão de fluorescência. Este sinal de longo comprimento de onda de fluorescência é então passado para um par de lentes de ambos os lados de um diafragma que é posicionado em um avião exatamente conjugado com o plano focal da lente objetiva. Fótons coletados a partir do volume focal do objeto são colimadospela lente objetiva e estão focados pelas lentes confocal através do pinhole. Fluorescência gerado acima ou abaixo do plano focal, portanto, não ser colimada corretamente, e não vai passar pelo pinhole confocal 1, a criação de uma secção óptica na qual apenas a luz do foco do microscópio é visível. (Fig. 1). Assim, o pinhole age efetivamente como uma abertura virtual no plano focal, restringindo a emissão detectada apenas uma localização espacial limitada. Comercial moderno microscópios confocal oferecer aos usuários uma operação totalmente automatizada, fazendo procedimentos de imagem anteriormente complexo relativamente simples e acessível. Apesar da flexibilidade e potência desses sistemas, comercial microscópios confocal não são adequados para todas as tarefas de imagem confocal, como muitos em aplicações de imagem in vivo. Sem a capacidade de criar sistemas de imagem personalizada para atender suas necessidades, experiências importantes podem ficar fora da reaçãoh para muitos cientistas. Neste artigo, nós fornecemos um método passo-a-passo para a construção completa de um costume, sistema de imagem de vídeo de taxa de confocal a partir de componentes básicos. O microscópio vertical será construído utilizando um espelho ressonante galvanométricos para fornecer o eixo de varredura rápida, enquanto um padrão de velocidade de espelho ressonante galvanométricos irá verificar o eixo lento. Para criar um feixe preciso digitalizados no foco da lente objetiva, esses espelhos serão posicionados nos planos chamados telecêntrica usando quatro lentes relay. Detecção confocal será realizada usando um padrão, tubo fotomultiplicador off-the-shelf (PMT), e as imagens serão capturadas e exibidas usando um cartão de framegrabber Matrox eo software incluído.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

A construção completa de um costume, sistema de imagens em tempo real confocal de varredura é descrito. Este sistema, que pode ser facilmente utilizado para vídeo-microscopia e taxa de microendoscopy, permite uma variedade de geometrias de imagem e aplicações que não sejam acessíveis usando o padrão comercial sistemas confocal, em uma fração do custo.

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

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