Name: video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Thorlabs por su apoyo a este proyecto. AJN desea agradecer el apoyo de una beca de la NSF Graduate. Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Nacionales de Salud a través del Nuevo Director de los NIH Programa Premio a la Innovación, el número de concesión una DP2 OD007096-01. Información sobre el Programa Innovator Award Nuevo en <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Los autores desean agradecer a Tom Hayes para el uso del laboratorio de Harvard Electronics.

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	<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 985-985 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li><li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics.">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li><li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging.">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li><li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration.">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation.">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li><li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+(Cell-viZio)+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation.">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li><li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+confocal+laser+endomicroscopy.">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li><li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy.">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li><li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li></ol>

La producción de este video este video fue patrocinado por Thorlabs, Inc.

Este sistema de imágenes de vídeo de tipo hace uso de un espejo de funcionamiento galvanómetros de resonancia alrededor de 8 kHz. Espejos de resonancia puede ser muy fuerte cuando se ejecuta a plena potencia, y su tono alto puede ser molesto o incluso peligroso en los tiempos de exposición suficiente. Aunque no se han presentado aquí, se recomienda proteger el espejo resonante galvanométrico dentro de una caja transparente para reducir significativamente el volumen del sistema y / o usar equipo de protección adecuada para los oídos, como tapones para los oídos. El espejo galvanómetros de resonancia escanea en un patrón sinusoidal. Sin embargo, las tarjetas de framegrabber leer en señal de asumir una frecuencia de barrido completamente lineal en las direcciones horizontal y vertical. Desde un barrido sinusoidal se ralentiza en los bordes de la exploración, los artefactos de compresión de imágenes se puede observar a lo largo del eje rápido de la imagen (horizontal). Una forma de minimizar este problema es conducir a propósito del espejo resonante galvo rango de lectura significativamente mayor que eldiámetro de la lente de relé. Al hacer esto, sólo la barra central de casi lineal de la trama de lectura sinusoidal recorrerá la muestra, reduciendo al mínimo las distorsiones de la imagen. Otro enfoque sería para procesar imágenes post-recogida para alinear el eje rápido. Esto se puede lograr mediante imágenes de un patrón conocido fluorescentes (como una rejilla) y el uso de las dimensiones de la forma conocida para crear una secuencia de comandos de procesamiento que unwarps las imágenes recogidas. Este sistema de escaneo en particular fue diseñada con el propósito de imágenes in vivo, que requiere a menudo una posición vertical orientada al video-tasa de microscopio. Para los experimentos de imagen celular, microscopios invertidos son más habitual. El diseño que aquí se presenta se pueden cambiar fácilmente para construir tal un microscopio invertido, todo lo que se requiere es una rotación de los últimos 2 espejo &quot;de diámetro. En lugar de orientar el espejo para dirigir el haz de exploración hacia abajo, el espejo puede dirigir el haz hacia arriba. La colocación de la lente del objetivo unot la misma distancia del espejo, junto con una etapa de la muestra que permite obtener imágenes en una geometría invertida. Si el sistema de imagen se construye exclusivamente para obtener imágenes de microendoscópica, no hay ninguna razón para &quot;doblar&quot; el diseño del microscopio vertical en absoluto. En cambio, el sistema de análisis completo se puede construir sobre una placa horizontal con un solo lente objetivo del paralelo orientado a la mesa óptica. Tenga en cuenta que el microscopio en esta versión utiliza una configuración de orificio fijo, mientras que esta prevé la construcción de mayor simplicidad y facilidad de adaptación, los usuarios que desean un sistema más versátil podría considerar la incorporación de un orificio variable, como se puede encontrar en la mayoría de los microscopios confocal comercial. Al permitir al usuario ajustar el tamaño del agujero de alfiler para compensar las muestras de mayor o menor intensidad de las emisiones, lo que permite al usuario optimizar mejor el equilibrio entre la fuerza de la señal y la resolución para una muestra dada. La chOZ de la fibra de la imagen seleccionada para el microscopio es importante. Recomendamos el uso de fibras de Sumitomo coherente de la imagen debido a su espaciamiento núcleo de la fibra y bajos en relación con autofluorescencia. Fibras de la imagen fabricado por Fujikura se ha encontrado que tienen altas cantidades de autofluorescencia 10, que puede abrumar a las débiles señales de fluorescencia de una muestra de la sensibilidad y el límite máximo de la microendoscope. Fibras Sumitomo manufacturados, tales como la 8-30N utiliza en esta configuración en particular, tienen niveles mucho más bajos que sus equivalentes de autofluorescencia Fujikura. Mientras haces de fibra de sanguijuelas puede ser considerado atractivo para microendoscopy, su diseño general, los lugares los núcleos individuales de fibra demasiado lejos, lo que significa que los núcleos de fibra de baja densidad de los objetos de la muestra, dejando fuera a importantes regiones de interés potencial. Por último, cabe señalar que mientras que el microscopio se describe aquí será útil en una variedad de ensayos in vitro e in vivo de solicomplementos y se pueden crear para una fracción del costo de un sistema comercial completa, que no tiene características como la detección de la luz transmitida, un ocular para ver, o una trayectoria del haz de no confocal de campo amplio de epifluorescencia. Si bien es posible construir un sistema con estas características desde el principio, los lectores que deseen un sistema que desee modificar un sistema comercial existente para satisfacer sus necesidades en lugar de iniciar una completamente nueva construcción.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de la pieza </td><td> Fabricante </td><td> Número del artículo </td><td> Especificaciones </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> 515 nm banda del filtro de paso </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lente acromática Doublet 25,4 mm Dia. x 50mm FL, revestimiento MgF2 </td><td> Edmund Óptica </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lente acromática Doublet 25,4 mm Dia. x 76,2 mm FL, revestimiento MgF2 </td><td> Edmund Óptica </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lente acromática Doublet 25,4 mm Dia. x 88.9mm FL, revestimiento MgF2 </td><td> Edmund Óptica </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Dia doblete acromático lente de 50 mm. x 300mm FL, revestimiento MgF2 </td><td> Edmund Óptica </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz de frecuencia R Scanner óptico de alta </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGC conductor </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA módulo fotosensor </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Limitación de corriente recomendados </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Alimentación </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Para su uso con H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS Objetivo </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios eA / XA Framegrabber tarjeta </td><td> Matrox </td><td> Solios eA / XA </td><td> MIL software necesario; OEM interconexiones recomienda </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fuente de alimentación 12V </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> 12 V, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscopio 5x lente del objetivo </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> NA 0.10, longitud 25,4 mm Focal </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fibra imagen coherente </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 tapón de rosca y Kit de hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 micras montado Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td> Ideal para la construcción de filtros espaciales </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Jaula 30 mm Cubo Clamp </td><td> Thorlabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Jaula 30 mm Sistema de Cubo, 4-Way </td><td> Thorlabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, de 5 MW, B Pin Code, diodo láser de fibra SM Pigtailed, FC / PC </td><td> Thorlabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Obsoletas de productos y fue sustituido por LP405-SF10 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> De 5 minutos de epoxy, 1 onza </td><td> Thorlabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 Eje cinemática óptica Monte </td><td> Thorlabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 tapón de rosca y Kit de hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 tornillo de fijación y kit de hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adaptador de Exteriores e Interior Temas RMS Temas SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. FC / PC y el colimador FC / APC, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> Thorlabs </td><td> CFC-2X-A </td><td> f = 2,0 mm </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fibra ajustable Adaptador colimador, roscadas SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Breadboard aluminio, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 rosca </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Diodo láser de sobremesa / controlador TEC </td><td> Thorlabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm de longitud de paso de espejo dicroico </td><td> Thorlabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Cinemática de montaje para Ø1 &quot;Óptica </td><td> Thorlabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC Monte de diodos láser de fibra Thorlabs Pigtailed </td><td> Thorlabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montaje de la lente óptica de Ø18 mm </td><td> Thorlabs </td><td> LMR18 </td><td> Un anillo de retención incluida </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Se monta la lente de 2 &quot;Óptica </td><td> Thorlabs </td><td> LMR2S </td><td> Con rosca interna y externa, incluido el anillo de retención </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Serie Jaula conjunto de la varilla, 6 &quot;mm de largo, Ø4, Cantidad 1. </td><td> Thorlabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Post Pillar pedestal, 8-32 Grifos, 1&quot; de largo </td><td> Thorlabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Post Pilar de extensión, longitud = 0,5 </td><td> Thorlabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Post Pilar de extensión, longitud = 0,75&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protegido espejo de plata, 3,2 mm de espesor </td><td> Thorlabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 rotación ajustable elemento de enfoque, L = 1&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;Protegido espejo de plata, 3,2 mm de espesor </td><td> Thorlabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 m Montado Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris baja deriva Ø1 &quot;cinemática montura del espejo </td><td> Thorlabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Baja deriva </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 lente de tubo, L = 1 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Un anillo de retención incluida </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 roscadas de 30 mm Placa de Cage, 0.35 &quot;de espesor </td><td> Thorlabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 a M25 adaptador roscado de componentes ópticos </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A24 </td><td> Externos e internos SM1 Temas Temas M25.5x0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Diam pequeño rayoeter Galvo sistema </td><td> Thorlabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tenedor pequeño de sujeción </td><td> Thorlabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;contrataladrarse ranura, universal </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Sistema de filtro espacial </td><td> Thorlabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole se vende por separado </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-enfriado de montaje para 5,6 y 9 mm Láser </td><td> Thorlabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Soporte vertical para Ayudas para diseño </td><td> Thorlabs </td><td> VB01 </td><td> Cada </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

La microscopía confocal se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología y las ciencias biomédicas, lo que permite una rápida y de alta sensibilidad y alta resolución de seccionamiento óptico de los sistemas complejos. La microscopía confocal se utiliza habitualmente, por ejemplo, para estudiar los objetivos específicos celulares 1, la dinámica del monitor en las células vivas 2-4, y visualizar la evolución en tres dimensiones de organismos enteros 5,6. Extensiones de los sistemas de visualización de imagen confocal, como microendoscopes confocal, permite imágenes de alta resolución en vivo 7 y actualmente se aplican a las imágenes de enfermedades y diagnóstico en la práctica clínica 8,9. La microscopía confocal ofrece en tres dimensiones resolución mediante la creación de las llamadas &quot;secciones ópticas&quot; utilizando sencilla óptica geométrica. En una norma de amplio campo del microscopio de fluorescencia generada a partir de una muestra es recogida por una lente objetivo y transmitida directamente a un detector. Mientras que aceptarpoder de las muestras de imágenes finas, las muestras de espesor desdibujado por fluorescencia generada por encima y por debajo del plano focal del objetivo. En contraste, la microscopía confocal permite el corte virtual, ópticas de las muestras, el rechazo fuera del foco de luz para construir de alta resolución representaciones tridimensionales de las muestras. Microscopios confocal lograr esta hazaña con una apertura confocal en la trayectoria del haz de detección. La fluorescencia de una muestra recogida por el objetivo se retransmiten a través de los espejos de exploración ya través del espejo primario dicroicas, un espejo cuidadosamente seleccionados para reflejar longitudes de onda cortas, como el haz de excitación láser al pasar el tiempo, Stokes-cambió de emisión de fluorescencia. Esta señal de fluorescencia de onda larga se pasa a un par de lentes a cada lado de un agujero de alfiler que se coloca en un plano exactamente conjugado con el plano focal de la lente del objetivo. Fotones recogidos en el volumen focal del objeto son colimadospor el objetivo y se centran en las lentes confocal a través del agujero. Fluorescencia generada por encima o por debajo del plano focal por lo tanto no se colimado correctamente, y no pasará a través del agujero de alfiler un confocal, la creación de una sección de óptica en la que sólo la luz del foco microscopio es visible. (Fig. 1). Así, el agujero de alfiler actúa efectivamente como una apertura virtual en el plano focal, limitando la emisión detectada a una sola ubicación espacial limitada. Modernos microscopios confocal comerciales ofrecen a los usuarios un funcionamiento totalmente automático, los procedimientos de toma de imágenes antes complejo relativamente sencillo y accesible. A pesar de la flexibilidad y potencia de estos sistemas, comercial microscopios confocal no son adecuados para todas las tareas de visualización de imagen confocal, como muchas aplicaciones de imagen en vivo. Sin la capacidad de crear imágenes de sistemas a medida para satisfacer sus necesidades, experiencias importantes pueden permanecer fuera de las reaccionesh para muchos científicos. En este artículo se proporciona un método paso a paso para la construcción completa de una costumbre, video sistema de tipo de imagen confocal de componentes básicos. El microscopio vertical se construye con un espejo de galvanómetros de resonancia para proporcionar el eje de barrido rápido, mientras que una velocidad estándar de resonancia espejo galvanométrico analizará el eje lento. Para crear un haz de escaneado preciso en el enfoque de la lente objetivo, estos espejos se colocará en los planos telecéntrico llamada con cuatro lentes de relé. Detección confocal se realiza mediante una norma, fuera de la plataforma de tubos fotomultiplicadores (PMT), y las imágenes se capturan y se muestran usando una tarjeta digitalizadora Matrox y el software incluido.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

La construcción completa de una costumbre, en tiempo real, sistema de microscopía confocal de exploración se describe. Este sistema, que puede ser fácilmente utilizada para microscopía de vídeo de tipo y microendoscopy, permite una gran variedad de geometrías de imágenes y aplicaciones que no son accesibles con los sistemas estándar confocal comercial, a una fracción del costo.

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