Name: one-day workflow scheme for bacterial pathogen detection and antimicrobial resistance testing from blood cultures
Uploaded: 2012-07-09T12:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי עזם Profileringsfonds (PF245).

<ol>
	<li>Wallet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+clinical+study+using+a+multiplex+real-time+PCR+test+for+the+detection+of+bacterial+and+fungal+DNA+directly+in+blood.">Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).</li><li>Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rapid+detection+of+bloodstream+infections+on+length+of+hospitalization+and+hospital+charges.">Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).</li><li>Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l., Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostics+working+group.+Reflections+and+proposals+to+assure+quality+in+molecular+diagnostics.">Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics.</a> Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).</li><li>Peters, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+the+diagnosis+of+bloodstream+infections.">New developments in the diagnosis of bloodstream infections.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).</li><li>Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+probes+for+the+diagnosis+of+clinically+relevant+bacterial+infections+in+blood+cultures.">Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).</li><li>Beuving, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+testing+of+grown+blood+cultures+by+combining+culture+and+real-time+polymerase+chain+reaction+is+rapid+and+effective.">Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+for+universal+antibiotic+susceptibility+testing.">Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).</li><li>Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+bacterial+load+by+real-time+PCR+using+a+broad-range+(universal)+probe+and+primers+set.">Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set.</a> Microbiol. 148, 257 (2002).</li><li>Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+susceptibility+testing+with+positive+BacT/Alert+blood+cultures+by+using+MicroScan+overnight+and+rapid+panels.">Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).</li><li>Vliegen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacteria+by+real-time+amplification+and+sequencing+of+the+16S+rRNA+gene.">Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene.</a> J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).</li><li>Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+MicroSeq+system+for+identification+of+mycobacteria+by+16S+ribosomal+DNA+sequencing+and+its+integration+into+a+routine+clinical+mycobacteriology+laboratory.">Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

פרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר של פתוגנים ומספק פרופיל מיקרוביאלית תפקודית שעלולה להוביל הממשל מוקדם של אנטיביוטיקה הולמים ובכך לשפר את הפרוגנוזה של חולים עם זיהומים בדם. בהתאם לתנאי המבוקשים של הבדיקה, כלומר עלות נמוכה, תפוקה גבוהה, להפוך מינימלית, בערך באותה תקופה, תנאי הבדיקה ניתן להתאים. ההליך כולו יכול להתבצע תוך יום עבודה אחד. יתר על כן, שני חלקים של פרוטוקול יכול להתבצע בעת ובעונה אחת, אשר מפחיתה את זמן סיבוב סביב באופן משמעותי. כפי שהוצגו כאן, את לוח הזיהוי מבחר של חיידקים ביותר רלוונטיות קלינית בבית החולים שלנו. מאז העיקרון המרכזי הוא מיקוד באזור 16S גנטי, בדיקות ספציפיות מיקרואורגניזמים אחרים יכול להיות מעוצב נוסף assay. Assay מלאה נועדה במקור לצורך ניתוח מהיר של תרבויות דם, אבל יכול לשמש גם לעיבוד של oיס חומרים לדוגמה. זהו גם המקרה של אנטיביוטיקה, אשר שימשו לצורך בדיקות רגישות אנטיביוטיקה: אנטיביוטיקה יותר או אחר ניתן להוסיף, בהתבסס על דפוסי התנגדות וקווים מנחים מקומיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד (NaCl) </td><td> מרק כימיקלים </td><td> 106404 </td><td> 0.9% במים </td></tr><tr><td> Vacutainer SST סרום Tube מפריד 5 מ&quot;ל </td><td> BD ניתוח מערכות </td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td> מילר Hinton II מרק </td><td> BD אבחון Dystems </td><td> 212322 </td><td> 44 גר &#39;/ ל&#39; במים </td></tr><tr><td> סרכזת Rotixa 50 RS </td><td> אנדריאס Hettich GmbH &amp; Co KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת 5415 D </td><td> Eppendorf </td><td> הופסק </td><td></td></tr><tr><td> Primers </td> &lt;td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> נה </td><td></td></tr><tr><td> בדיקות </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biosystems </td><td> נה </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental מאסטר מיקס 2.0 </td><td> יישומי Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBRGreen Supermix </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp אופטי 96-ובכן פלייט תגובה </td><td> יישומי Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp דבק אופטי הסרטים </td><td> יישומי Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> קיו 96-ובכן ה-PCR צלחות </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B דבק אטמים </td><td> ביו רד העבודהatories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> בזמן אמת PCR מערכת איתור </td><td> יישומי Biosystems </td><td> ABI PRISM 7900HT </td><td></td></tr><tr><td> Real-Time PCR מערכת איתור </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MyiQ בודד צבע </td><td></td></tr></tbody></table>

one-day workflow scheme for bacterial pathogen detection and antimicrobial resistance testing from blood cultures

זיהומים בדם קשורות עם שיעורי תמותה גבוהים עקב גילוי סביר של אלח דם, אלח דם חמור הלם ספטי 1. לכן, הממשל מהירה של טיפול אנטיביוטי הולם הוא בעל חשיבות ובראשונה לטיפול בזיהומים בדם. אלמנט קריטי בתהליך זה הוא העיתוי, תלויה במידה רבה את התוצאות של זיהוי חיידקים בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה. שני פרמטרים אלה מתקבלים באופן שוטף על ידי בדיקה תרבות מבוססת, וזה זמן רב לוקח על 24-48 שעות בממוצע 2, 4. מטרת המחקר הייתה לפתח את ה-DNA על בסיס מבחני לזיהוי מהיר של זיהום בדם, כמו גם הרגישות מהירה בדיקה מיקרוביאלית. Assay הראשון הוא 16S eubacterial rDNA מבוסס בזמן אמת assay PCR השלמה עם המין או הסוג הספציפי בדיקות 5. באמצעות בדיקות אלה, חיידקים גראם שליליים, כולל Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosaו Escherichia coli וכן חיידקים גראם חיוביים כולל Staphylococcus spp., סטפילוקוקוס אוראוס, אנטרוקוקוס spp., סטרפטוקוקוס spp., ו Streptococcus pneumoniae ניתן היה להבחין. שימוש assay multiprobe, זיהוי הראשונה של מיקרו אורגניזם סיבתי ניתנה לאחר 2 שעות. שנית, פיתחנו assay למחצה מולקולרית לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה של ש &#39; aureus, אנטרוקוקוס spp. ו (פקולטטיבי) aerobe גראם שליליים מוטות 6. Assay זו התבססה על מחקר שבו PCR נעשה שימוש כדי למדוד את התפתחותם של חיידקים 7. חיידקים שנקטפו ישירות תרבויות דם מודגרת במשך 6 שעות עם מבחר של אנטיביוטיקה, ובעקבות Sybr הירוק מבוסס בזמן אמת assay PCR קובע עיכוב הצמיחה. השילוב של שתי השיטות יכול לכוון את הבחירה של טיפול אנטיביוטי מתאים באותו יום (איור 1). לסיכום, ניתוח מולקולרי של הזדהות ושל רגישות לאנטיביוטיקה מציע אלטרנטיבה מהירה יותר לזיהוי הפתוגן יכול לשפר את האבחנה של זיהומים בדם.

Watch this Scientific Journal Video about One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures at JoVE.com

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

העיצוב של התוכנית של יום אחד פשוט העבודה עבור אבחון פתוגן חיידקי מאפשרת זיהוי מהיר של זיהומים בדם. הכללת שמונה מטרות חיידקים רלוונטיות קלינית ופרופילים אנטיביוטיות ההתנגדות שלהם מציע תובנה המטפל הראשוני באותו יום, מה שעלול להוביל טיפול הולם יותר.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...