Name: prediction of hiv-1 coreceptor usage (tropism) by sequence analysis using a genotypic approach
Uploaded: 2011-12-01T13:00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach at JoVE.com

Författarna finansieras från Corus, MedSys cellinmatning, kedja och Resina projekt.

Protokollet sammanfattas i figur. 4. 1. Insamling av blodprover <ol><li> Samla minst 3 ml blod i EDTA-rör vid den kliniska platsen. </li><li> Proverna kan förvaras upp till en vecka vid 4 ° C. </li><li> Skicka EDTA-blodprover så snart som möjligt till laboratoriet med vanlig post. </li></ol> 2. Isolering av HIV RNA och / eller DNA <ol><li> Skaffa viralt RNA och / eller DNA från 1000 xl helblod, serum eller plasma, med Magna Ren Kompakt nukleinsyraisolering I kitet I och Magna Ren Compact Systemet. </li><li> Eluera den fick RNA eller DNA i 50 pl TE-buffert. Alternativt kan andra nukleinsyror reningsförfaranden användas. </li></ol> 3. Amplifiering av env-regionen Amplifiera env-regionen (fig. 2 och 4) från antingen plasma-RNA eller proviralt DNA. En 1245 bp lång produkt, innefattande huvuddelen av Env-proteinet (nt 6556-7811 according till HXB2) genereras. <ol><li> RNA-prover: RT-PCR-reaktion <ol><li> Viralt RNA uppvisar en mycket komplex sekundärstruktur (fig 4) som kan hindra RT-reaktionen. För att undvika detta problem, inkubera 10 pl RNA vid 65 ° C under 10 minuter (redan i PCR-rör och i PCR-maskinen) och sedan sänka temperaturen till 50 ° C. </li><li> Tillsätt 40 | il av PCR Master Mix inklusive primrarna Env-F och Env-R. Master Mix för RT-PCR In-House-system: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volym / reaktion (il) </td><td> slutlig koncentration </td></tr><tr><td> RNas-fri H-2 O </td><td> 14,4 </td><td></td></tr><tr><td> 5x buffert (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-lösning </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP-blandning (10 mM vardera) </td> &lt;td&gt; 2 </td><td> 400 | iM av varje dNTP </td></tr><tr><td> Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 iM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 pM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 pM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 pM </td></tr><tr><td> RNas-inhibitor (RNasin) </td><td> 1 </td><td> 5 enheter / reaktion </td></tr></tbody></table> Env-F: 5&#39;-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 &#39;(nt 6556 → 6586 enligt HXB2) Env-R: 5&#39;-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 &#39;(nt 7785 ← 7811) </li><li> Kör RT-reaktionen vid 50 ° C under 30 minuter. </li><li> Kör den första PCR enligt följande: <table border="1"><tbody><tr><td> 95 ° C, 15 min </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sek 50 ° C, 30 sek 72 ° C, 2 minuter </td&gt; <td> 1 X </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sek 56 ° C, 30 sek 72 ° C, 2 minuter </td><td> 38 X </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 minuter 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol></li><li> DNA-prover: PCR-reaktion För provirala DNA-prover, är ingen initial RT-reaktion behövs, och PCR-reaktionen kan direkt starta. <ol><li> Tillsätt 40 | il av PCR Master Mix till 10 pl provial DNA. Master Mix för PCR In-House-system: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volym / reaktion (il) </td><td> slutlig koncentration </td></tr><tr><td> RNas-fri H-2 O </td><td> 15,4 </td><td></td></tr><tr><td> 5x buffert (HotStarTaq DNA-polymeras) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-lösning </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP-blandning (10 mM vardera) </td><td> 2 </td><td> 400 | iM av varje dNTP </td></tr><tr><td> Enzym-Mix (HotStarTaq DNA-polymeras) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 iM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 pM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 pM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 pM </td></tr></tbody></table> Env-F: 5&#39;-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 &#39;(nt 6556 → 6586) Env-R: 5&#39;-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 &#39;(nt 7785 ← 7811) </li><li> Kör PCR-betingelser som tidigare beskrivits för RNA-prover (steg 3.1.4). </li></ol></li></ol> 4. Amplifiering av V3-regionen: innesluten PCR <ol><li> För innesluten PCR, använder 5 pl från den första PCR-reaktionen (utan föregående analys i agarosgel) som templat och tillsätt 95 pl av PCR MasTER Blanda. Master Mix för kapslade-In-House-PCR <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volym / reaktion (il) </td><td> slutlig koncentration </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 61,9 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PCR-buffert </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-lösning </td><td> 20 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP-blandning (10 mM vardera) </td><td> 2 </td><td> 200 pM av varje dNTP </td></tr><tr><td> Primer Env-2F (100 pM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 pM </td></tr><tr><td> Primer Env-2R (100 pM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 pM </td></tr><tr><td> HotStarTaq DNA-polymeras </td><td> 0,5 </td><td> 2,5 enheter / reaktion </td></tr></tbody></table> Env-2F: 5&#39;-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 &#39;(nt 6838 → 6864) <strong&gt; Env-2R: 5&#39;-CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3 &#39;(nt 7712 ← 7742) </li><li> Kör PCR enligt följande: <table border="0"><tbody><tr><td> 93 ° C, 15 min </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sek 50 ° C, 30 sek 72 ° C, 90 sek </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sek 56 ° C, 30 sek 72 ° C, 90 sek </td><td> 43 X </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 minuter 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Analysera PCR-produkten på en 1% agarosgel (fig. 4). Den förväntade produkten är 902 bp lång. </li><li> Rening av sekvenseringen proven. <ol><li> Rena PCR-produkten med Qiagen PCR-Purification Kit, med hjälp av protokollet, lösningar och mikro-kolonner som tillhandahålls av leverantören. Eluera på 30-100 pl PE-buffert, beroende på bandintensitet. </li><li> Alternativt kan proven renas med användning ExonukleasJag och Fast AP (Thermo alkaliskt fosfatas). För detta ändamål, lägg 6 pl exo-AP-Mix till 15 pl PCR-produkt och inkubera 15 minuter vid 37 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> 580 pl H-2 O </td></tr><tr><td> 66 ul snabb AP </td></tr><tr><td> 13,4 ul Exo I </td></tr></tbody></table></li></ol></li></ol> 5. Sekvens reaktion av V3 amplikon <ol><li> Sekvensen reaktion består av en PCR-reaktion med användning av endast en av följande primrar: Env-2: 5&#39;-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980) Env-5: 5&#39;-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 &#39;(nt 7352 ← 7371) Env-6: 5&#39;-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 &#39;(nt 6979 → 7000) Env-7: 5&#39;-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 &#39;(nt 7530 ← 7549) Env-10: 5 &#39;- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3&#39; (nt 7478 ← 7507) Env-11: 5 &#39;- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3&#39; (nt 7638 ← 7664) Första val primers är: Env-2, Env-6 eller Env-7, Env-11 </li><li> Använd 1 pl från det renade V3 amplikonen som mall och tillsätt 9 ul PCR Master-mix. Sekvensering Master Mix: <table border="1"><tbody><tr><td> 4 pl sekvens blandning (HIV-Genotypning Kit) </td></tr><tr><td> 4 il H 2 O </td></tr><tr><td> 1 il primer (100 pmol / | il) </td></tr></tbody></table></li><li> Kör sekvensen reaktionen enligt följande: <table border="0"><tbody><tr><td> 96 ° C, 10 sek </td><td></td></tr><tr><td> 50 ° C, 10 sek </td><td> 36 X </td></tr><tr><td> 60 ° C, 45 sek </td><td></td></tr><tr><td> 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol> 6. Rening av sekvenseringen proverna Rena sekvenser USIng Sephadex G-50 superfine. <ol><li> Fyll lämpligt antal brunnar i &quot;kolumnen loader&quot; med Sephadex G-50 superfine. Överför Sephadex till filterplattan MAHVN4510 genom att vrida på. </li><li> Lägg 300 pl Milli-Q-H-2 O till varje brunn i filterplattan, och inkubera den i minst 3 timmar vid 2-8 ° C. </li><li> Centrifugera plattorna under 5 minuter vid 910Xg och 4-15 ° C. Kassera genomflödet. </li><li> Tillsätt 10 pl H 2 O till sekvensen produkten och sedan pipettera sekvensen på den svällda Sephadex plattan. </li><li> För att få den renade produkten, centrifugera plattan under 5 min. vid 910Xg och 4-15 ° C och samla genomflödet. </li></ol> 7. Sekvensering de renade proverna på sequencern ABI Prism 3130 XL <ol><li> Före varje körning, ändra bufferten och kontrollera volymen av polymeren (POP7). Vid behov, byt ut gamla polymeren kolven med en ny. </li><li> Använd de sparade kör villkor, inklusive en injektion tid på 18 sekunder. </li><li> I denna maskin tar insamling av signaldata för en körning med 16 sekvens prover ungefär 60 minuter (36 cm kapillär) eller 150 minuter (50 cm kapillär). </li></ol> 8. Sekvens redigering <ol><li> Använd programmet Lasergene (DNA-stjärna) till anpassa och redigera sekvenserna (Fig. 5). Andra sekvens redigering program kan användas. Använd en &quot;V3-Consensus B&quot; och env konsensussekvensen som referenser. </li><li> Lasergene skapar en konsensus sekvens av analyserade provet med hjälp av alla rådata som finns och lagra den som FASTA fil. FASTA filen är en textfil som innehåller en rubrik med namnet på provet och nukleotidsekvensen. </li></ol> 9. Sekvensering tolkning av data och tropism förutsägelse <ol><li> Sekvensering tolkning av data utförs av webbaserade tolksystem geno2pheno [coreceptor] ( <a href="http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php">http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/</a>index.php). För tropism förutsägelse kan olika FPR inställningar väljas. Standardinställningen är enligt den tysk-österrikiska terapi riktlinjer. För FPR ≥ 20%, viruset klassas som R5 när FPR ≥ 20% och X4 för FPR &lt;12,5%. </li><li> Ladda FASTA filen i servern. Denna server översätter nukleotidsekvensen till aminosyror, justerar den med V3-Consensus B-sekvensen och ger en subtyp klassificering. Dessutom genererar den en förutsägelse av coreceptor användning (bild 4) uttryckt som falskt positiva ränta (FPR). </li></ol> 10. Representativa resultat Den geno2pheno [coreceptor] utgång visar en graderad tolkning av tropism. Beroende på sannolikheten för coreceptor användning varierar tolkningen text och bakgrundsfärg från grön (&lt;20% FPR), vilket tyder på ett säkert administration för MVC, till gult, vilket tyder på en möjlig, låg risk och slutligen till rött. Rött är färgen tyderning inte förskriva MVC. Dessutom genererar servern en pdf rapport som kan skrivas ut, fyllas med patientens och data prov, och skickas till läkaren. Exempel på geno2pheno [coreceptor] utgång visas i figur. 6. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig1.jpg" /> Figur. 1. Schematisk replikation av HIV. Virionen måste binda till de cellulära CD4 som receptor och till antingen CCR5 eller CXCR4 som coreceptor. Den coreceptor CCR5 kan blockeras med CCR5-antagonister som Maravirok (MVC, Celsentri, Selzentry). Efter fusion av de virala och cellulära membran, är den virala nukleokapsiden frigörs i cytoplasman. Nukleokapsiden demonteras och det virala RNA-komplexet frigörs in i cytoplasman. Viralt omvänt transkriptas (RT) transkriberar det genomiska RNA till proviralt DNA, som sedan transporteras till kärnan och integreras i värdgenomet genom HIV-integras. Cellulärt RNA polymeraser TRAnscribe viral genomisk och RNA budbärare från provirala genomet. De virala proteinerna produceras i cytoplasman och transporteras till cellytan. Viruset partiklar knopp som omogna, icke-infektiösa virioner från cellerna. HIV-proteas klyver proteiner som producerar för smittsamma partiklar. Inhibering av en av stegen leder till ett avbrott i replikationscykeln. De antiretrovirala läkemedel och replikering steg att de hämmar är markerade i rött. De viralt RNA och proviralt DNA (material som används för tropism eller motstånd analys) är markerade i grönt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig2.jpg" /> Figur 2. HIV-proviralt genomet. Hiv partikeln är byggd med olika strukturella proteiner och hus olika enzymer och proteiner från både virala och cellulära ursprung. Figuren visars placeringen av gener inom det virala genomet. Ytan proteiner gp120 och gp41 utgör spikar på ytan av virionen och kontakta den humana cellen att utföra membranfusion. I den nedre delen av figuren, är PCR-amplifieringsprodukterna och de primrar som används i vår protokoll visas. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig3.jpg" /> Figur 3. Andel patienter med låg virusmängd (VL) mätningar analyseras för läkemedelsresistens eller tropism beslutsamhet vid Institutet för virologi, Universitetet i Köln (Tyskland). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig4.jpg" /> Figur 4. Övergripande system för experimentet .. Vänligen <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig4_lg.jpg">klicka här för</a> att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig5.jpg" /> Figur 5. Sekvens redigering med Lasergene. V3 amplikon sekvenseras med åtminstone en framåt och en omvänd primer. Lasergene alignes de &quot;. Abi&quot;-filer som erhållits från sequencer med referensen sekvenser &quot;V3-Consensus B&quot; och env. Lasergene skapar en konsensussekvens använda alla rad uppgifter. De referensbränslen sekvenserna kan märkas (och visas sedan i grått), så att de inte bidrar till provet konsensussekvensen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig6.jpg" /> Figur 6. Tropism förutsägelse rapporter som genereras av geno2pheno [coreceptor] tool.The rapporter genereras som pdf-filer som kan sparas och fyllas i på datorn. Ytterligare data som vi patientens namn, datum för blod utvinning etc. kan manuellt inkluderas med en PDF Writer-program. Särskilda kommentarer kan också tillsättas. These uppgifter uteslutande på användarens dator och inte på geno2pheno [coreceptor] server. Vänligen <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig6_lg.jpg">klicka här för</a> att se en större version av denna siffra.

<ol>
	<li>Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+coreceptor+proficiency+panel+test.">European coreceptor proficiency panel test.</a> , (2011).</li><li>Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+prediction+of+HIV+coreceptor+usage.">Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage.</a> Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).</li><li>McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+Sequencing+of+the+V3-loop+Is+Comparable+to+the+Enhanced+Sensitivity+Trofile+Assay+in+Predicting+Virologic+Response+to+Maraviroc+of+Treatment-na+ve+Patients+in+the+MERIT+Trial.">Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial.</a> , (2010).</li><li>Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc+in+treatment-experienced+patients+with+HIV-1+infection+-+experience+from+routine+clinical+practice.">Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice.</a> Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).</li><li>Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+genotypic+prediction+of+HIV-1+coreceptor+use+versus+a+phenotypic+assay+and+correlation+with+the+virological+response+to+maraviroc:+the+ANRS+GenoTropism+study.">Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).</li><li>Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+accuracy+of+the+geno2pheno+co-receptor+algorithm+for+predicting+HIV+tropism+for+single+and+triplicate+measurements+of+V3+genotype.">Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype.</a> , (2010).</li><li>Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., Garc&#237;a, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genotypic+assay+for+the+prediction+of+HIV-1+coreceptor+tropism+and+guiding+the+use+of+CCR5+antagonists+in+clinical+practice.">Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice.</a> , (2010).</li><li>Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., F&#228;tkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+determination+and+clinical+outcome+of+61+patients+under+MVC+treatment.">Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment.</a> , (2010).</li><li>Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., K&#246;ppe, S., &#252;&#252;nsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+testing+from+proviral+DNA+-+analysis+of+a+subgroup+from+the+Berlin+Maraviroc+cohort.">Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort.</a> , (2010).</li><li>Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+guidelines+on+the+clinical+management+of+HIV-1+tropism+testing.">European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing.</a> Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).</li><li>Walter, H., Eberle, J., M&#246;ller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empfehlung+zur+Bestimmung+des+HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs+(DAIG+Recommendations+for+the+HIV-1+tropism+testing).">Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing).</a> , (2011).</li><li>Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., K&#246;ppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+genotypic+co-receptor+tropism+testing+from+viral+RNA+and+proviral+DNA:+week+24+analysis+of+the+Berlin+maraviroc+cohort.">Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort.</a> Journal of the International AIDS Society. 13, 129-129 (2010).</li><li>Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+HIV-1+Co-receptor+Tropism+Using+PBMC+Proviral+DNA+Derived+from+Aviremic+Blood+Samples.">Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples.</a> , (2010).</li></ol>

Denna video artikeln är sponsrad av ViiV Healthcare och GlaxoSmithKline.

V3-sekvensen medger en tillförlitlig virala tropismen förutsägelse, som visas i kliniska studier 3-9. I själva verket är genotypiska beslutsamhet övervägs i de nuvarande europeiska och tysk-österrikiska riktlinjerna 10. Jämfört med fenotypiska tester, inte bara är omsättningen kortare (ekvivalent med resistensbestämning), utan även är kostnaderna. Dessutom är en stor fördel med genotypiska tester att resultaten klassificeras som FPR och kan därför anpassas till patienternas behov. Trofile resultat, å andra sidan, är helt enkelt R5 eller X4 rapporter och tillgång till rådata anges inte. För närvarande är de europeiska riktlinjerna föreslår en FPR cut-off 20% 10, medan de österrikisk-tyska riktlinjerna tillåter anpassa FPR cut-off specifikt till varje patients behov 11. I denna linje, för patienter med ett brett utbud av antiretrovirala läkemedel alternativ, högre FPR cut-off (&gt; 20%) är rekommavslutades. Omvänt, för kraftigt förbehandlade patienter med begränsade behandlingsalternativ, lägre FPR cut-off (&gt; 5%) kan användas. Denna typ av terapi vägledning pågår med resistensbestämning till NRTI, NNRTI, PI och Inis, där delvis aktiva läkemedel kan ingå i behandlingen av patienter med nedsatt terapeutiska alternativ. Dessutom, med allt fler genotypiskt-styrda terapi förändringar, kliniskt relevant FPR cut-offs ständigt justeras med en panel av bioinformatiker, virologer och kliniker. En annan viktig fördel med genotypiska tropism testning är möjligheten att analysera kliniska prover med mycket låg eller till och med odetekterbar virusmängd (VL). I detta fall, när plasma-RNA inte amplifierbara, kan det provirala DNA sekvenseras och användas för tillförlitliga förutsägelser 9,12. Att notera, har antalet patienter med låg eller ej detekterbar virusmängd ökat kraftigt under de senaste åren. Hittills, Trofile analysen tillåter endast analys av prover från patienter med VL &lt;1000 kopior / ml. Emellertid har preliminära studier visat att proviralt DNA kan också adecuate att testas med Trofile 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Magna Ren Kompakt nukleinsyraisolering Kit I </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04 802 993 001 </td><td></td></tr><tr><td> Magna Ren Compact Systemet </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 03731146001 </td><td></td></tr><tr><td> T3000 Thermocycler </td><td> Biometra </td><td> 050-723 </td><td></td></tr><tr><td> One Step RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210.215 </td><td></td></tr><tr><td> HotStarTaq Master Mix Kit </td><td> Qiagen </td><td> 203.445 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28.106 </td><td></td></tr><tr><td> Exonukleas I (Exo I) </td><td> Fermentas </td><td> EN0582 </td><td></td></tr><tr><td> FastAP värmekänsliga Alkaline Phosphatase </td><td> Fermentas </td><td> EF0651 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4337457 </td><td></td></tr><tr><td> Sephadex G-50 Superfine </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0041-01 </td><td></td></tr><tr><td> ABI Prism 3130 XL kapillär sekvenserare </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3130XL </td><td></td></tr></tbody></table>

prediction of hiv-1 coreceptor usage (tropism) by sequence analysis using a genotypic approach

Maravirok (MVC) är den första licensierade antiretrovirala läkemedel från klassen coreceptor antagonister. Det binder till värden coreceptor CCR5, som används av de flesta HIV-stammar för att infektera de humana immunceller (Fig. 1). Andra HIV-isolat använder en annan coreceptor, CXCR4. Vilken receptor används, bestäms i viruset av Env-protein (fig. 2). Beroende på den använda coreceptor, är virusen klassas som R5 eller X4, respektive. MVC binder till CCR5-receptorn inhiberar inträdet av R5 virus i målcellen. Under sjukdomen kan X4 virus uppstår och växa R5 virus. Fastställande av coreceptor användning (även kallad tropism) är därför obligatoriskt före administrering av MVC, som begärts av EMA och FDA. Studierna för MVC effektivitet motivera, meriter och 1029 har utförts med Trofile analysen från Monogram, San Francisco, USA Det här är en högkvalitativ analys baserad på Sophisticated rekombinanta tester. Acceptansen för detta test för daglig rutin är ganska låg utanför USA, eftersom de europeiska läkarna snarare tenderar att arbeta med decentraliserade expertlaboratorier, som också ger samtidig resistenstestning. Dessa laboratorier har genomgått flera utvärderingar kvalitetssäkring, det sista en som presenteras i 2011 1. Under flera år har vi utfört tropism bestämningar baserade på sekvensanalys från HIV-env-V3-gen-regionen (V3) 2. Denna region bär tillräckligt med information för att göra en tillförlitlig prognos. Den genotypisk bestämning av coreceptor användning ger fördelar såsom: kortare omsättningstid (motsvarande resistensbestämning), lägre kostnader, möjlighet att anpassa resultaten till patienternas behov och möjlighet att analysera kliniska prover med mycket låg eller till och med odetekterbar virusmängd (VL ), särskilt eftersom antalet prover som analyseras med VL &lt;1000 kopior / ilgrovt ökat under de senaste åren (fig. 3). De viktigaste stegen för tropism test (Fig. 4) visade i denna video: 1. Uppsamling av ett blodprov 2. Isolering av HIV-RNA från plasma och / eller HIV-proviralt DNA från mononukleära blodceller 3. Amplifiering av env-regionen 4. Amplifiering av V3-regionen 5. Sekvens reaktion av V3 amplikon 6. Rening av sekvenseringen proverna 7. Sekvensering de renade proverna 8. Sekvens redigering 9. Sekvensering tolkning av data och tropism förutsägelse

Watch this Scientific Journal Video about Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach at JoVE.com

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Förutsägelsen av coreceptor användning av HIV-1 krävs för administrationen av en ny klass av antiretrovirala läkemedel, dvs coreceptor antagonister. Det kan utföras genom sekvensanalys av<em&gt; Env</em&gt; Gen och efterföljande tolkning genom ett internetbaserat tolkning system (geno2pheno<sub&gt; [Coreceptor]</sub&gt;).

Prediktion av HIV-1 coreceptor användning (Tropism) genom sekvensanalys med en genotypisk strategi

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/video/4153"> Espa&ntilde;ol </a>

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

Bedömning av immunologiskt Relevanta Dynamic tertiär strukturella drag av HIV-1 V3 Loop Crown R2 sekvens av Ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Särskild märkning av HIV-1 positiva celler med hjälp av en Rev-beroende Lentiviral Vector uttrycka det grönt fluorescerande proteinet

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Struktur av HIV-1 kapsid församlingar med Cryo-elektronmikroskopi och Iterativ Helical Real-utrymme återuppbyggnad

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 kärnor

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nya verktyg för att expandera reglerande T-celler från HIV-1-infekterade individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Utvärdering av HIV-1 trimera Envelope Glycoproteins användning av en cellbaserad ELISA-analys

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av exosomes från plasma HIV-1 positiva individer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisering av HIV-1 Gag Bindning Giant enlamellvesikel (GUV) Membran

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...