Name: a pcr-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of imperata cylindrica
Uploaded: 2012-02-20T12:00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica at JoVE.com

우리는 표본을 얻기에 도움 앨런 Tasker (USDA-진딧물, Riverdale, MD), 스티븐 콤튼 (클렘슨), 셰리 Aultman (클렘슨), 크레이그 램지 (USDA-진딧물, 포트 콜린스, 콜로라도), 그리고 베티 Marose (UMD)를 감사 . 우리는 비디오의 촬영에 그의 작업에 대한 학생 앤드류 아드리안 (UA-헌츠빌)와 데릭 대커 (UA-헌츠빌)이 프로토콜을 테스트하고 그들의 도움, 그리고 요셉 Herdy 감사드립니다. 이 작품은 국립 수산 및 야생 동물 재단에 의해 후원되었다.

<ol>
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우리는 공개 할게 없다.

<html> 미국의 보육 및 조경 산업은 이국적이고 새로운 식물 종을 재배하고 판매에 번성. 무역의 성장 세계화의 결합 이것은, 침입 식물 종 (种)을 입력 수립, 그리고 미국에서 연방 정부가 침략이 될 수있는 가능성을 포함하여 자주 사용할 수없는 정보에 의존 그러한 식물을 조절하는 능력을 확산 것이라는 가능성을 증가 , 토종과 귀화 taxa의 올바른 분류법, 그리고 유전 distinctness. 침입 식물이 우리의 지식은 종종 제한이기 때문에, 숨겨진 침입 특성과 수입 식물은 기꺼이 그들만이 우리 농업과 자연 자원을 침해하는 나중에 배우고 도입되었습니다. 이 프로토콜은 저와 관련된 이러한 문제를 해결하는 것을 목표로 정확하게 야생 형 cogongrass과 관상용 JBG의 대응의 복귀 형태를 구분할 수있는 최초의 단순 분자 방법을 제공하여 cylindrica 품종. 이 프로토콜의 개발을위한 jove_content &quot;&gt;은 야생 형 cogongrass은 2008 년 6 월 제이 플로리다 인근 산타 로사 카운티의 연못 크릭 임업 단위에서 귀화한 인구로부터 수집되었다. JBG는 상업 탁아소 (블루버드 보육, INC로부터 조달되었다 .. Riverdale, MA의 대학 공원 일부터 6 월 2009 년;) 6 월 2008 년뿐만 아니라 콜롬비아에서 주택 소유자의 컬렉션에서 미주리 JBG 준 2008 년 클렘슨 대학, 사우스 캐롤라이나에서 캠벨 지질 박물관의 안뜰에서 얻은 있었을갑니다 및 콜롬비아, 2009 년 미주리 (리랜드 Cseke 식별)의 주택 소유자의 정원에서. 모든 식물은 헌츠빌에서 알라바마의 대학 (헌츠빌, AL)에있는 온실에서 유지되었다. 이들 식물에서 수집한 DNA의 유전자 시퀀싱은 일반적으로 바코드 식물 2로 사용 9 독립적인 DNA 영역의 깊이 비교에 포함되어있었습니다. 모든 경우에서, JBG의 시퀀스를 따라서하는 데 도움 JBG 되돌릴 분들에게 100 % 일치했다JBG 실제로 녹색, 침입 형태로 되돌리려는 것을 확인합니다. 오직 핵 ITS와 엽록체 trnL-F 영역은 유전자 cogongrass와 JBG 구별하는 데 사용할 수있는 차이점이 있습니다. trnL-F 지역은 2 SNPs 2 InDels합니다 (삽입 및 삭제)이있는 동안은 ITS 지역, cogongrass와 JBG 사이 세 SNPs (단일 염기 polymorphisms)의 총 있습니다. 이러한 유전적 차이는 야생 형 cogongrass와 JBG이갑니다 구분 수있는 개발되는 다양한 특정 PCR의 primers를 허용했다. 가장 안정적인 결과는 plastid trnL-F 지역에서 파생된 primers에서 왔습니다. 따라서이 프로토콜은 cogongrass, JBG의 엽록체의 게놈의 trnL-F 지역 및 JBG (그림 4) 되돌 간의 순서의 차이에 따라 달라집니다. 문제의 종류, 더 구체적인 primers를 생성할 수 있도록하고 밀접하게 관련 종, 야외에서 잘못된 반응을 방지하기 위해I.의 리터 알려져 trnL-F 시퀀스 cylindrica 품종은 관련 잔디 종 (29 종 43 독립적인 시퀀스, 예를 들어, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, Miscanthus sinensis의, Saccharum officinarum, 수수 halepense)에서 trnL-F 시퀀스와 비교되었다. 우리는 잔디, 다양한 특정 primers의 특이성의 29 여종에 걸쳐 다양한 전용 프라이머 시퀀스를 검사 있지만 종합적으로 대부분의 다른 잔디 종에서 DNA를 증폭하는 기능에 대해 검사되지 않았습니다. 따라서 DNA 추출에 사용되는 조직은 신중하게 나로 식별되어야합니다 cylindrica 전에이 프로토콜을 시작합니다. 잔디는 다음 cogongrass 또는 JBG 중으로 확인할 수 없다면 우리는 시퀀스 cogongrass 또는 JBG에 정확히 일치하는 것을 확인하기 위해 PCR 제품을 시퀀싱하는 것이 좋습니다. 현재 주어진 잔디 시편의 신원을 확인하는 가장 정확한 방법은 t 모두에서 PCR을 수행하는 것입니다rnL-F와 ITS 지역 시퀀스 PCR 제품을 확인하고 정확하게 식별 taxa에서 알려진 시퀀스의 시퀀스를 비교하여 따라갔다. DNA가 컨트롤이 프로토콜에 설명된 primers (trnL-F 지역의 경우) 또는 다른 primers 기타 출판물 13-15에서 해당 이용할 수를 사용하여 증폭 할 수 있습니다. 시퀀싱이 훨씬 노동 및 간소화된 절차를 사용하여보다 집중적인 비용입니다. PCR에 사용된 primers의 품질은 프로 시저의 성공에 중요합니다. 우리는 경사 바이오 주식 회사 (에서 제공하는이 절차에 대한 primers를 만들었 <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , 헌츠빌, AL). 경사 바이오에서 primers 주문에 대한 장점은 그들이 우리 실험실에서 최적화에 사용된 primers와 같은 동일한 샘플 생산 시리즈에서 각 프라이머의 aliquots 다수를 저장한다는 것입니다. 따라서, primers는 같은 순서를 가지고 있지만, t 없습니다야이 프로토콜에 사용되었습니다 동일한 생산 많이에서 왔어요. 같은 많은로부터 primers를 사용하여 PCR의 primers의 품질의 차이에서 발생할 수있는 절차에 필요없는 변수를 방지하는 데 도움이됩니다. 마찬가지로 다른 DNA 형성 촉매의 polymerases는 PCR, 사용된 DNA 형성 촉매 효소의 품질을 위해 좋을 동안 PCR 결과의 품질에 영향을 미칠 것이다. PCR 시약의 더 나은 일관성을 허용하기 위해, 우리는 Clontech의 시약을 사용하여 프로토콜을 최적화했습니다. 장점이 효소는 (Clontech, 캘리포니아 주 마운틴 뷰, 고양이 # 639201 또는 639202) 강력한, 핫 스타트 DNA 형성 촉매의 중합 효소의 혼합물과 높은 특이성과보다 정확한 amplifications를 제공하는 데 도움이 증명 독서 효소이다. 이 프로토콜은 maternally 목초에서 상속되는 엽록체의 DNA에 의존하기 때문에 cogongrass 및 JBG의 genotypes 사이의 하이브리드화 이벤트는 우리의 분자 식별 절차에 캡처되지 않을 수 있습니다. hypridization가 suspe는 경우cted, 우리는 양쪽 부모로부터 상속됩니다 핵 영역을 사용하는 것이 좋습니다. 식물 genotyping에서 고려해야 할 가장 일반적으로 사용되는 비 plastid 변수 영역은 핵 ribosomal ITS 지역 13-15,17입니다. 현재, 우리는 동일한 PCR 튜브에 핵 ITS 영역의와 엽록체 trnL-F 영역의 증폭을 멀티플렉싱으로 진전된다. 핵 DNA 영역으로 plastid 멀티플렉싱하는 것은 잠재적으로 홀로 중 하나를 사용하는 한계를 우회할 것이다 있지만, 이러한 방법은 케이스별로 사건에 타당성을 결정하는 최적화 및 추가적인 평가가 필요합니다. 정량 실시간 PCR (qPCR)과 같은 분자 비콘 (형광 프라이머 프로브) 등 최신 기술의 사용은 또한 고장 안전하고 정확한 식물 genotyping 방법으로 취급되고있다. 여기에 제시된 프로토콜은 JBG는 야생 형 cogongrass의에서 되돌릴 구별하는 빠르고 안정적​​인 접근 방식을 제공합니다. 우리는 사용 권장이 프로토콜의 RS는이 프로토콜의 사용에서 파생된 결과를보고하기 위해 저희에게 연락하십시오. 이러한 공유 정보 JBG는 되돌려의 분포에 관한 정보를 제공하는 데 도움이됩니다. 이것은 USDA의 규제가 매우 침략적 cogongrass 품종의 보급과 잠재 하이브 리다이 제이션을 회피 할 수있는 행동에 객관적인 판단을 내릴 도움이 될 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DNeasy 식물 미니 키트 </td><td> Qiagen, 발렌시아, 캘리포니아 </td><td> 69,104 또는 69,106 </td><td> 양질의 DNA를 얻을 모든 평판 게놈 공장의 DNA 키트는 다음 절차에 대해 잘 동작한다. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0578 </td><td> 앞으로 긍정적인 제어 입문서 </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;엑손)-C </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0579 </td><td> 긍정적인 컨트롤 프라이머를 역방향 </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0864 </td><td> 앞으로 야생 형 cogongrass의 프라이머 </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0865 </td><td> 개머리판야생 형 cogongrass의 프라이머 </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0866 </td><td> 앞으로 JBG와 프라이머를 되돌 JBG </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0867 </td><td> JBG와 프라이머를 되돌 JBG를 바꾸게되면 </td></tr><tr><td> 장점 UltraPure PCR dNTP 믹스 </td><td> Clontech, 캘리포니아 주 마운틴 뷰 </td><td> 639,125 </td><td></td></tr><tr><td> 장점이 중합 효소 </td><td> Clontech, 캘리포니아 주 마운틴 뷰 </td><td> 639,201 또는 639,202 </td><td> 좋은 증거 독서, 핫 스타트 DNA 형성 촉매의 중합 효소 </td></tr></tbody></table>

a pcr-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of imperata cylindrica

야생 형 저 cylindrica (cogongrass)는 부정적인 아프리카, 아시아, 유럽, 뉴질랜드, 오세아니아 및 미주 1-2에 걸쳐 73 개국에서 농업과 천연 자원에 영향을 미치는, 세계 10 대 최악의 침입 식물 중 하나입니다. Cogongrass는 토착 식물 종의 큰 다양성을 치환하고 차례로 마초와 쉼터를위한 전이 원시 식물 수종에 따라 야생 동물을 위협 빠르게 - 확산, monodominant 스탠드를 형성합니다. 문제를 추가하려면, 관상용 다양한 [나 cylindrica VAR. koenigii (Retzius가)] 널리 Imperata cylindrica &#39;Rubra&#39;, 레드 바론, 일본 혈액 풀 (JBG)의 이름하에 판매됩니다. 이것은 다양한 putatively 살균 및 비침 투이며 붉은 단풍을위한 바람직한 관상용으로 간주됩니다. 그러나, 정확한 조건 하에서, JBG가 가능한 종자를 생산할 수있다 (캐롤 Holko 2009 개인 통신)와 나는 녹색으로 되돌릴 수 있습니다그것이 야생 형 침략 다양한 4 (그림 1)의 구분되는 특징에 걸릴 cogongrass에서 종종 구별할 수있다 nvasive 형식입니다. 이것은 신분도 잘받은 식물 taxonomists 위해 형태학 어려운 작업을 사용하여 만듭니다. 공격적인 녹색 표현형에 JBG의 복귀도 드문 아닙니다. 코딩 및 원자력과 엽록체 둘 다 DNA의 변수 영역의 시퀀스 비교를 사용하여, 우리는 JBG는 메릴랜드, 사우스 캐롤라이나, 그리고 미주리 주에서 내에 녹색 침략으로 되돌 것으로 확인되었습니다. 활성 cogongrass의 침입이 아닌 곳에 JBG는 대륙 미국에서 거의 모든 국가에서 판매하고 심은되었습니다. 잘 이해되지에서는 되돌릴 문제의 범위는 되돌 식물 문서화하고 종종 파괴 때문이다. 이 분자 프로토콜의 응용 JBG가갑니다 식별할 수있는 방법을 제공하고 공동 발생이 품종을 유지하는 데 도움ND 가능성이 hybridizing. Cogongrass가 다른 유전자형으로 건널 때 고맙게 여기게 outcrosser이며, - 바람의 분산 가능한 생산 5-7 넓은 거리를 통해 cogongrass 뿌리 씨앗을하실 수 있습니다. JBG는 cogongrass보다 약간 다른 유전자형을 가지고 있으며, cogongrass으로 가능한 하이브리드를 구성할 수 있습니다. 문제를 추가하려면, JBG는 cogongrass 8-10보다 추위와 관용 그늘이고,이 두 품종 간의 유전자 흐름은 더 공격적이다 하이브리드를 생성할 가능성이 야생 형 cogongrass보다 성의 관용, 그리고 차가운 그늘. 야생 형 cogongrass 현재 동남 미국에서 전세계 100 만 490여 헥타르, 감염 시켰어 있지만 그것은 500,000헥타르 통해 감염 시켰어하고 빠르게 북쪽의 광범위한 틈새 시장 및 지리적 잠재 3,7,11에 의한 확산으로 미국의 대부분을 차지하는이 가능합니다. 유전자 건널목의 잠재력은 USDA-진딧물 연방 유해 주 프로그램에 대한 심각한 우려입니다. 현재 USDA-진딧물은 주와 무에서 JBG 금지오히려 주요 cogongrass의 infestations (예, 플로리다, 알라바마, 미시시피)가 있습니다. cogongrass와 JBG 자신의 배포판을 확장할 그러나 결합에서 두 품종을 방지하는 것은 더 어려울 수 있습니다. 또한, JBG 되돌릴 수의 배포는 현재 알려지지 조직 형태를 통해 이러한 품종을 식별하는 능력없이 일부 cogongrass의 infestations은 JBG는 되돌려의 결과가 될 수도 있습니다. 불행히도, 신분의 현재 분자 방법은 일반적으로 소모 및 비용 시간은 둘 다 AFLP (증폭 단편 길이 Polymorphisms)와 DNA 시퀀싱에 의존하고 있습니다. 여기서는 정확 cogongrass와 JBG 되돌릴 구별하는 최초의 비용 절감 효과 및 안정적인 PCR 기반의 분자 genotyping 방법을 제시한다.

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A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

우리는 엽록체 trnL-F 스페이서 지역 내의 대상의 DNA 서열 차이의 종류를 구분하는 것이 다양한 특정 PCR primers의 직원을 고용하고 비용 효과적이고 신속한 분자 genotyping 프로토콜을 제공<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (cogongrass) 혼자 형태로 구분할 수없는. 이러한 종류의 연방 목록에 유해 잡초, cogongrass과 밀접하게 관련, 넓은 확산 장식 다양성, 내가 포함<em&gt;. cylindrica</em&gt; VAR.<em&gt; koenigii</em&gt; (일본어 혈액 풀).

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