Name: visualization of mitochondrial respiratory function using cytochrome c oxidase / succinate dehydrogenase (cox/sdh) double-labeling histochemistry
Uploaded: 2011-11-23T12:00:00
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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, Schweden Research Council, Schwedisch Brain Power und Schwedisch Brain Foundation unterstützt. Vielen Dank an Mattias Karlen und Dr. Giuseppe Coppotelli für kreative Unterstützung bei der Abbildung 1 und 2 zeigen; Karin Pernold für technische Hilfe und Drs. Barry J. Hoffer, Lars Olson, und Nils-Göran Larsson für viele hilfreiche Ratschläge und Diskussion.

1. Tissue Vorbereitung Kryoschneiden <ol><li> Sacrifice das Tier entweder durch Genickbruch oder Enthauptung, im Einklang mit den verfügbaren ethischen ermöglichen. </li><li> Schnell sammeln Gewebe von Interesse (zB. Gehirn), und schnell auf Trockeneis (Gewebe kann Einfrieren in Isopentan oder Propan mit flüssigem Stickstoff gekühlt, um eine optimale Morphologie zu erhalten benötigen) einfrieren. Shop Gewebe in Aluminiumfolie bei -80 ° C bis zu seiner Sektion. </li><li> Embed gefrorenen Gewebe in Vorber...

<ol>
	<li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mitochondrial+DNA+mutations+in+mammalian+aging.">Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).</li><li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).</li><li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biologic+clock:+the+mitochondria.">The biologic clock: the mitochondria.</a> J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).</li><li>Wallace, D. 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Biol. 38, 1-14 (1968).</li><li>Dubowitz, V., Brooke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Biopsy:+A+Modern+Approach.">Muscle Biopsy: A Modern Approach.</a> , (1973).</li><li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+oxidase+deficient+cells+accumulate+in+the+hippocampus+and+choroid+plexus+with+age.">Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age.</a> Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).</li><li>Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+histochemical+determination+of+succinic+dehydrogenase+activity+in+skeletal+muscle+fibres.">Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres.</a> Histochem. J. 20, 230-243 (1988).</li><li>Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. 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Genet. 50, 934-949 (1992).</li><li>Petruzzella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+high+levels+of+mutant+mtDNAs+co-localize+with+cytochrome+c+oxidase-negative+ragged-red+fibers+in+patients+harboring+a+point+mutation+at+nt+3243.">Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243.</a> Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).</li><li>Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+encephalomyopathies+in+childhood.+I.+Biochemical+and+morphologic+investigations.">Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations.</a> J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).</li><li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in-depth+evaluation+of+suspected+mitochondrial+disease.">The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease.</a> Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).</li></ol>

Die kombinierte COX / SDH histochemische Methode ermöglicht die Visualisierung von Zellen mit mitochondriale Dysfunktion. Diese Technik, die mit früheren Studien aus dem Jahr 1968, nach wie vor beliebt, mit vielen bedenkt es den &quot;Goldstandard&quot; zur Erkennung mitochondrialer Erkrankungen bei Patienten, 14,19,26,27. Es ist jetzt häufig verwendet, um mtDNA-Mutation-driven Altern und altersbedingte Erkrankungen 12,13,18,20,21,24 untersuchen. Die COX / SDH Doppel-Kennzeichnung wird häufig p...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Dry Ice </td><td> AGA Gas AB </td><td> Blockform </td><td></td></tr><tr><td> Isopentan (2-Methyl-butan) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 277258 CAS: 78-78-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cyrostat Einbettung Lösung </td><td> Sakura Finetek </td><td> Tissue Tek 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Microm </td><td> Microm Modell HM 500M </td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td> Super Frost Plus- Menzel Gläser J1800AMWZ </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser Borosilikatglas </td><td> VWR International </td><td> 16004-098 </td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> Filter Paper </td><td> Munktell Filter AB </td><td> Qualität: 1350 ArtikelAnzahl: 242 001 </td><td> 430 x 430 mm </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Sigma flüssiges Substrat System, D7304 </td><td></td></tr><tr><td> Cytochrom c (Typ III, von Pferden Herz) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2506 CAS: 9007-43-6 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Katalase (aus Leber) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9322 CAS: 9001-05-2 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroblautetrazolium (NBT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N6876 CAS: 298-83-9 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumsuccinat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S2378 CAS: 6106-21-4 </td><td></td></tr><tr><td> Phenazinmethosulfat (PMS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9625 CAS: 299-11-6 </td><td> PMS ist lichtempfindlich. Schild aus Licht. </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8032 CAS: 26628-22-8 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Xylol </td><td> VWR International </td><td> EM-XX0060-4 </td><td></td></tr><tr><td> Entellan </td><td> VWR International </td><td> 100503-870 </td><td></td></tr><tr><td> Malonat (Malonsäure) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1296 CAS: 141-82-2 </td><td></td></tr></table>

visualization of mitochondrial respiratory function using cytochrome c oxidase / succinate dehydrogenase (cox/sdh) double-labeling histochemistry

Mitochondriale DNA (mtDNA) Mängel sind eine wichtige Ursache von Krankheit und kann zugrunde liegen, Alterung und altersbedingte Veränderungen 1,2. Die mitochondrialen Theorie des Alterns legt eine Rolle für die Mutationen der mtDNA, die Bioenergetik Homöostase und zelluläre Funktion zu ändern, in dem Alterungsprozess 3 können. Eine Fülle von Beweisen zur Stützung dieser Theorie 1,4, ein Beispiel ist die mtDNA Mutator Maus 5 zusammengestellt worden, jedoch ist die genaue Rolle von mtDNA Schaden in alternden nicht ganz verstanden 6,7. Die Beobachtung der Tätigkeit der Atemwege Enzyme ist ein einfacher Ansatz für die Untersuchung mitochondriale Dysfunktion. Komplex IV, oder Cytochrom c Oxidase (COX), ist essentiell für die Funktion der Mitochondrien. Die katalytischen Untereinheiten der COX durch mtDNA codiert und sind für die Montage der Anlage (Abbildung 1) von wesentlicher Bedeutung. So sind richtige Synthese und Funktion weitgehend auf mtDNA Integrität 2.Obwohl auch andere respiratorische Komplexe untersucht werden konnte, sind Komplexe IV und II die meisten zugänglich histochemische Untersuchung 8,9. Complex II oder Succinat-Dehydrogenase (SDH), ist vollständig von Kern-DNA (Abbildung 1) kodiert, und seine Aktivität ist in der Regel nicht durch eine Störung der mtDNA betroffen, obwohl ein Anstieg mitochondrialen Biogenese 10-12 hindeuten könnten. Die gestörte mtDNA beobachtet in der mitochondrialen Krankheiten, Alterung und altersbedingter Krankheiten führt oft auf die Anwesenheit von Zellen mit geringer oder fehlender COX-Aktivität 2,12-14. Obwohl COX-und SDH-Aktivitäten einzeln untersucht werden können, hat die sequentielle Doppel-Kennzeichnung Methode 15,16 erwies sich bei der Suche nach Zellen mit mitochondriale Dysfunktion 12,17-21 vorteilhaft. Viele der optimalen Verfassung des Assays ermittelt worden sind, wie Substratkonzentration, Elektronen-Akzeptoren / Geber-, Zwischen-Elektronen-Carrier, Einfluss von pH-Wert, und die Reaktion time 9,22,23. 3,3 &#39;-Diaminobenzidin (DAB) ist eine effektive und zuverlässige Elektronendonator 22. In Zellen mit funktionierendem COX, wird die braune Indamin Polymerprodukt in der mitochondrialen Cristae lokalisieren und zu sättigen Zellen 22. Diejenigen Zellen, die mit dysfunktionalen COX wird daher nicht von der DAB Produkt gesättigt sein, so dass für die Visualisierung von SDH-Aktivität durch Reduktion von Nitroblautetrazolium (NBT), einen Elektronenakzeptor, zu einem blauen Formazan Endprodukt 9,24. Cytochrom c und Natriumsuccinat Substrate werden hinzugefügt, um endogene Werte zwischen Steuerung und kranken / mutierten Gewebe 9 normalisieren. Katalase ist als Vorsichtsmaßnahme, um mögliche Verunreinigung Reaktionen von Peroxidaseaktivität 9,22 vermeiden aufgenommen. Phenazinmethosulfat (PMS), einem Zwischenprodukt Elektronen-Carrier, wird in Verbindung mit Natriumazid, eine Atmungskette Inhibitor, der zur Bildung des endgültigen Reaktionsprodukte 9,25 zu erhöhen. Trotz dieser KenntnisATION, einige wichtige Details, die die Folge dieser schicklich einfache Test, zusätzlich zur Spezifität Kontrollen und Fortschritte in der Technik, noch nicht vorgestellt worden.

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Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Die Cytochrom-c-Oxidase / Natrium-Dehydrogenase (COX / SDH) Doppel-Kennzeichnung Methode erlaubt die direkte Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Enzymmangel in frisch-gefrorenen Gewebeschnitten. Dies ist eine einfache histochemische Technik und ist nützlich bei der Untersuchung mitochondrialer Krankheiten, Alterung und altersbedingte Erkrankungen.

Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Research

JoVE Journal

Biology

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