Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00
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Die Autoren sind sehr dankbar, RJ Sommer und X Wang für die Unterstützung bei Mikroinjektion, sowie aufschlussreiche Kommentare von den anonymen Gutachtern. Diese Arbeit wird durch NIH SC2GM089602 unterstützt.

1. Transgenese: DNA-Präparation <ol><li> Dominant Co-Injektion Marker: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)] Die pRL3 Plasmid ist ein dominantes Co-Injektion Marker für visuell identifiziert erfolgreiche Transformation Veranstaltungen. Dieses Plasmid kodiert für eine dominante mutierte Allel (tu92) des PPA-prl-1-Gen eng mit der SQT-1 Kollagen-Gens in C. im Zusammenhang elegans und verwandelt den Wildtyp sinusförmige Bewegung in Uhrzeigersinn drehen Bewegungen entlang ...

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

P. pacificus Populationen sind in enger Zusammenarbeit mit verschiedenen Skarabäus Arten weltweit gefunden und ist ein Modell, Nematoden der Mitte zwischen frei lebenden und Nematoden. Die Stärke des P. pacificus als ein Modell Organismus lag in der Integration seiner genetischen und physikalischen Karten, die positionelle Zuordnung von Mutanten aus unvoreingenommene freuen genetischen Screens isoliert zu fördern (dh nicht nur für Kandidatengene zuvor in C. elegans charakterisiert...

<table border="1"><tbody><tr><th> Produkt: </th><th> Catalog #: </th><th> Lieferant: </th></tr><tr><td> DMI3000 Injection Mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Mikroinjektor Manipulator (Direct Drive) </td><td> Narashige BC-3 Kugelgelenk </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Needle Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Mikroinjektor ™ All-Digital Multi-Druck-System </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Cloning Jet-Set </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET Plasmid Miniprep Kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Concentrator ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo Forschung </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® Transcription Kit </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Edle </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Wissenschaftlich </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas (1,5 bis 0,16 bis 0,19 mm dick, Größe: 50 x 45mm) </td><td> 12 bis 554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Glaskapillaren (Filament) </td><td> 615000 </td><td> AM-Systeme </td></tr><tr><td> Paraffinöl (Heavy) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

Zwar ist es immer günstiger für neue Modell-Organismen vollständig sequenzierten Genomen zu erhalten, weitere eingehende Genfunktion und Expressionsanalysen durch RNA-Interferenz und stabile Transgenese beschränkt bleiben in vielen Arten aufgrund der besonderen Anatomie und molekulare Zellbiologie des Organismus. Zum Beispiel haben außerhalb der Krone Gruppe Caenorhabditis dass Caenorhabditis elegans 3, stabil übertragen transgenen Linien in nicht-Caenorhabditis Arten gehören nicht in dieses scheinbare Stamm (Nematoda) berichtet worden, mit Ausnahme der Zwergfadenwurm 4 und Pristionchus pacificus 5. Zur Erleichterung der wachsenden Rolle von P. pacificus in das Studium der Entwicklung, Evolution und Verhalten 6-7, beschreiben wir hier die aktuellen Methoden zur Mikroinjektion zur Herstellung transgener Tiere und Gen-knock down von RNAi nutzen. Wie die Keimdrüsen <em&gt; C. elegans und die meisten anderen Nematoden, die Keimdrüsen von P. pacificus ist syncitial und in der Lage Einbeziehung DNA und RNA in die Oozyten, wenn sie durch direkte Mikroinjektion geliefert. Im Gegensatz zu C. elegans jedoch stabil transgene Erbschafts-und somatische Expression in P. pacificus erfordert die Zugabe von selbst genomischer DNA mit Restriktionsendonukleasen komplementär zu den Enden der Ziel-Transgenen und Koinjektions Marker 5 verdaut. Die Zugabe von Carrier genomische DNA ist vergleichbar mit der Forderung nach Transgenexpression in Zwergfadenwurm 4 und in den Keimzellen von C. elegans. Es ist jedoch nicht klar, ob die spezifischen Anforderungen für die Tiere eigene genomische DNA ist, weil P. pacificus soma ist sehr effizient zum Schweigen zu nicht-komplexe multi-copy-Gene oder extrachromosomale Arrays in P. pacificus benötigen genomischen Sequenzen für die ordnungsgemäße Montage Kinetochor während der Mitose. Die ventralen Migration des zweiarmigen (didelphic) Gonaden in Hermaphroditen erschwert die Fähigkeit, sowohl Gonaden in einzelnen Würmer 8 zu injizieren. Wir zeigen auch die Verwendung von Mikroinjektion den Zuschlag eine dominante Mutante (roller, tu92) durch die Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in den Keimdrüsen zu Non-Rolling F 1 Nachkommen zu erhalten. Im Gegensatz zu C. elegans, aber wie die meisten anderen Nematoden, P. pacificus PS312 ist nicht empfänglich für systemische RNAi über Fütterung und Tränkung und daher dsRNA müssen durch Mikroinjektion in die syncitial Gonaden angewendet werden. In dieser aktuellen Studie hoffen wir, die Mikroinjektion Prozess benötigt wird, um ein PPA-EGL-4 Promotor verwandeln beschreiben:: GFP-Reporter und Knockdown eine dominierende Rolle prl-1 (tu92)-Mutante in einer visuell informative Protokoll.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung illustrieren<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Für ein Studium in der Evolution, Entwicklungs-und Verhaltensbiologie.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

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In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Forschung

Biologie

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One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

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Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...