Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

המחברים מודים מאוד RJ זומר ו-X וואנג לסיוע עם microinjection, כמו גם הערות תובנה מן הבודקים אנונימי. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק SC2GM089602.

1. Transgenesis: הכנת ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן דומיננטי שיתוף הזרקה: pRL3 [PPA-PRL-1 (tu92)] הפלסמיד pRL3 הוא סמן דומיננטי שיתוף הזרקה עבור חזותית זיהוי אירועים טרנספורמציה מוצלחת. פלסמיד זה מקודד עבור אלל מוטנט דומיננטי (tu92) של הגן PP...

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

פ אוכלוסיות פקיפיקוס נמצאים בשיתוף הדוק עם מינים שונים חיפושית חיפושית ברחבי העולם הוא נמטודות מודל ביניים בין חיים חופשיים נמטודות טפיליות. כוחה של פ פקיפיקוס כאורגניזם מודל המתעוררים טמון בשילוב של מפות גנטיות הפיזי שלה כי לקדם מיפוי מיקומית של מוט...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> המוצר: </th><th> קטלוג #: </th><th> הספק: </th></tr><tr><td> DMI3000 הזרקת מיקרוסקופ </td><td> DMI3000 </td><td> לייקה </td></tr><tr><td> Microinjector מניפולטור (נסיעה ישירה) </td><td> Narashige BC-3 בול משותף </td><td> Tritech מחקר </td></tr><tr><td> מחט פולר </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech מחקר </td></tr><tr><td> MicroInjector ™ All-Digital Multi-לחץ מערכת </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> Tritech מחקר </td></tr><tr><td> GeneElute ™ היונקים הדנ&quot;א הגנומי Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> pJet שיבוט Jet ערכת </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET פלסמיד Miniprep ערכת </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> ה-DNA Clean &amp; מרוכז ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO מחקר </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi Topo ® ערכת שעתוק </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> אגר Difco ™ נובל </td><td> DF0142-15-2 </td><td> פישר Scientifi </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ (1.5-0.16 עד 0.19mm עבה; גודל: 50 x 45 מ&quot;מ) </td><td> 12-554-F </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> זכוכית נימים (נימה) </td><td> 615000 </td><td> AM מערכות </td></tr><tr><td> שמן פרפין (קשה) </td><td> O122-1 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

למרות זאת הוא סביר יותר ויותר עבור אורגניזמים מודל המתעוררים להשיג רצף הגנום לחלוטין, נוסף מעמיק פונקציה גן ומנתח ביטוי על ידי התערבות RNA ו transgenesis יציב להישאר מוגבלת מינים רבים בשל האנטומיה בפרט ביולוגיה תאית מולקולרית של האורגניזם. כך, למשל, מחוץ Caenorhabditis קבוצת כתר הכולל Caenorhabditis elegans 3, המשודר ביציבות קווי מהונדס שאינם Caenorhabditis מינים לא דווחו מערכה זו מטעה (Nematoda), למעט Strongyloides stercoralis 4 ו Pristionchus פקיפיקוס 5. כדי להקל את תפקידו המתרחב של פ פקיפיקוס במחקר של התפתחות, אבולוציה, התנהגות 6-7, נתאר כאן את השיטות הקיימות להשתמש microinjection להכנת חיות טרנסגניות ואת הגן להפיל על ידי RNAi. כמו בלוטות המין של <em&gt; ג elegans ורוב נמטודות אחרים, בלוטות המין של פ פקיפיקוס הוא syncitial ומסוגלים שילוב DNA ו-RNA לתוך ביציות כאשר נמסר על ידי microinjection ישיר. שלא כמו ג elegans עם זאת, transgene ירושה יציבה ביטוי סומטי פ פקיפיקוס דורש תוספת של הדנ&quot;א הגנומי עצמי מעוכל עם endonucleases משלים את הקצוות של transgenes היעד סמנים coinjection 5. תוספת של הדנ&quot;א הגנומי הספק דומה הדרישה לביטוי transgene ב Strongyloides stercoralis 4 והן בתאי הנבט של C. elegans. עם זאת, לא ברור אם דרישה ספציפית של הדנ&quot;א הגנומי שלו של החיות הוא כי פ פקיפיקוס סומה הוא יעיל מאוד השתקת שאינם מורכבים רב להעתיק את הגנים או מערכים extrachromosomal ב P. פקיפיקוס דורשים רצף גנומי להרכבה kinetochore נאות במהלך מיטוזה. ההגירה הגחון של שני חמושים (didelphic) בלוטות המין של הרמפרודיטים מסבכת עוד יותר את היכולת להזריק הן בלוטות המין של תולעים הפרט 8. אנחנו גם מדגימים את השימוש microinjection כדי מציאה מוטציה דומיננטית (הרים, tu92) על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך בלוטות המין כדי להשיג ללא גלגול 1 הצאצאים F. שלא כמו ג elegans, אבל כמו נמטודות האחרים, פ &#39; פקיפיקוס PS312 אינו פתוח RNAi מערכתי באמצעות האכלה השריית ולכן dsRNA חייב להיות מנוהל על ידי microinjection לתוך בלוטות המין syncitial. במחקר הנוכחי, אנו מקווים לתאר את התהליך microinjection צורך להפוך האמרגן PPA-EGL-4:: כתב ה-GFP היתוך מציאה הרים דומיננטי PRL-1 (tu92) מוטציה בפרוטוקול מידע חזותי.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות necromenic<em&gt; Pristionchus פקיפיקוס</em&gt; ללימודי הביולוגיה האבולוציונית, התפתחותיים, התנהגותיים.

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

לוקליזציה RNAi ו ביטוי גנים מחוץ לרחם של עלוקה מרפא

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

משלוח חיידקית של RNAi effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...