Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

저자는 microinjection뿐만 아니라 익명의 검토에서 통찰력의 의견과 도움을 RJ 서머와 X 왕 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 NIH 부여 SC2GM089602에 의해 지원됩니다.

1. Transgenesis : DNA의 준비 <ol><li> 지배적인 공동 사출 표시 : pRL3 [PPA - prl - 1 (tu92)] pRL3 플라스미드 시각 성공적으로 변환 이벤트를 식별을위한 지배적인 공동 분사 마커입니다. 이 플라스미드는 밀접 C.에있는 sqt - 1 콜라겐 유전자와 관련된 PPA - prl - 1 유전자의 돌연변이 allele 지배 (tu92)에 대한 인코딩 elegans와 벌레의 몸은 축 1.5을 따라 시계 방?...

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

P. pacificus의 인구는 전세계 다양한 풍뎅이 딱정벌레의 종들과 긴밀한 연관에서 발견 무료 생활 기생 nematodes 사이의 중간 모델 선충류집니다. P.의 강도 새로운 모델 유기체로 pacificus은 불편 앞으로 유전 화면에서 격리 돌연변이의 위치 매핑을 증진의 유전자와 물리적지도의 통합에 누우면 (즉,뿐만 아니라 이전에 C. elegans의 특징 후보 유전자에 대한) 6,10. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 제품 : </th><th> 카탈로그 # : </th><th> 공급 : </th></tr><tr><td> DMI3000 사출 현미경 </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinjector를 조작하는 사람 (직접 운전) </td><td> Narashige BC - 3 볼 조인트 </td><td> Tritech 연구 </td></tr><tr><td> 니들 풀러 </td><td> Narashige PC - 10 </td><td> Tritech 연구 </td></tr><tr><td> MicroInjector ™ 모든 - 디지털 다중 압력 시스템 </td><td> Narashige MINJ - D </td><td> Tritech 연구 </td></tr><tr><td> GeneElute ™ 포유류의 게놈 DNA Miniprep 키트 </td><td> G1N70 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> pJet 복제 제트 키트 </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET 플라스미드 Miniprep 키트 </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA 클린 ​​&amp; 농축기 ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO 연구 </td></tr><tr><td> BLOCK - IT ™는 RNAi TOPO ®의 전사 키트 </td><td> K3500 - 01 및 K3650 - 0일 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ 한천 귀족 </td><td> DF0142 - 15-2 </td><td> 피셔 Scientifi </td></tr><tr><td> 현미경 덮개 유리 (1.5-0.16에 0.19mm 두께, 크기 : 50 X 45mm) </td><td> 12-554 - F </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> 유리 모세관 (필라멘트) </td><td> 615,000 </td><td> AM 시스템 </td></tr><tr><td> 파라핀 오일 (중공업) </td><td> O122 - 1 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386 - 500 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> 나이 HPO 4 </td><td> AC20651 - 5000 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80 - 500 </td><td> 피셔 과학 </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

그것은 RNA 간섭하고 안정적​​인 transgenesis에 의해 유전자의 기능과 표현 분석 - 깊이에서 추가, 완전히 합성 genomes를 얻을 특정 해부와 유기체의 분자 세포 생물학으로 인해 많은 종류에 제한 남아 있습니다.하는 새로운 모델 생물에 대해 점점 더 저렴한 있지만 예를 들어, 안정되지 않은 Caenorhabditis 종의 유전자 변형 라인을 전송 Caenorhabditis elegans 3 포함 왕관 그룹 Caenorhabditis 외부 Strongyloides stercoralis 4 Pristionchus pacificus 5를 제외하고,이 그럴듯한 문 (Nematoda)에보고되지 않았습니다. P.의 역할 확대를 촉진하기 위해 개발, 진화, 그리고 행동 6-7의 연구 pacificus, 우리는 여기에 유전자 변형 동물과 gene RNAi에 의해 아래로 노크를 만드는 microinjection을 사용하는 현재의 방법을 설명합니다. 의 생식​​선과 마찬가지로 <em&gt; C. elegans와 대부분의 다른 nematodes, P.의 생식선 pacificus은 syncitial 직접 microinjection에 의해 전달되는 oocytes에 DNA와 RNA를 통합이 가능합니다. C. 달리 P.의 elegans 그러나 안정 transgene 상속 및 체세포 표현 pacificus은 대상 transgenes 및 coinjection 마커 5 끝까지 보완 endonucleases와 소화 자기 게놈의 DNA를 추가할 필요합니다. 캐리어 게놈의 DNA의 Strongyloides stercoralis 또한 4와 C의 배아 세포에서 transgene 표현에 대한 요구 사항과 비슷합니다 elegans. 동물들의 자신의 게놈의 DNA에 대한 특정 요구 사항이있는 경우 그러나, 그것은 명확하지 않기 때문에 P. pacificus 소마이 아닌 복잡한 다중 복사 유전자를 입을 또는 매우 효율적입니다 P.에 extrachromosomal 배열 pacificus은 유사 분열하는 동안 적절한 kinetochore 조립에 대한 게놈 시퀀스가 필요합니다. 두 무장 (의 복부 마이 그 레이션광고에 나온것에 didelphic) 생식선 추가 개별 웜 8 양쪽 생식선을 삽입하는 능력을 복잡. 우리는 또한 최저의 비 롤링 F 1 자손을 얻기 위해 생식선에 두 번 좌초 RNA (dsRNA)를 주사하여 지배적인 돌연변이 (롤러, tu92)에 microinjection의 사용을 보여줍니다. C. 달리 elegans지만, 대부분의 다른 nematodes처럼, P. pacificus PS312은 먹이와 몸으로 따라서 dsRNA가 syncitial 생식선에 microinjection에 의해 관리되어야합니다 통해 체계적 RNAi에 수용하지 않습니다. 현재이 연구에서 우리는 PPA - egl - 4 모터를 변환하는 데 필요한 microinjection 과정을 설명하도록하겠습니다 : : GFP에 융합 기자와 최저의 지배 롤러 prl - 1 (tu92) 시각 정보를 프로토콜에 돌연변이.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi는 특정 mRNA의 성적 1-2 최저 수있을 때 모델 생물에서 transgenesis는 유전자 기능을 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 necromenic 선충류에 안정적으로 전송 DNA와 과도를 두 번 좌초 RNA를 소개하는 데 필요한 기술을 설명하는 것을 목표로<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; 진화 발달, 행동 생물학의 연구.

RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

현지화된 RNAi과 약용 거머리의 이소성 유전자 발현

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

연구

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNAi Effectors의 세균성 배송 : Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...