Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

Авторы очень благодарны RJ Соммер и X Ван за помощью микроинъекции, а также проницательные комментарии от анонимных рецензентов. Эта работа проводится при поддержке гранта NIH SC2GM089602.

1. Трансгенез: ДНК подготовки <ol><li> Доминирующие совместно инъекций маркера: pRL3 [PPA-ПРЛ-1 (tu92)] PRL3 плазмиды доминирующей совместно инъекции маркер для визуального выявления успешных событий трансформации. Эта плазмида кодирует доминирующие мутантный аллель (tu92) из PPA-...

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

П. расШсиз населения находятся в тесной связи с различными скарабей видов по всему миру и представляет собой модель нематоды промежуточным между свободными и паразитических нематод. Сила П. расШсиз в качестве новой модели организма заключается в интеграции ее генетические и...

<table border="1"><tbody><tr><th> Продукт: </th><th> Каталог #: </th><th> Поставщик: </th></tr><tr><td> DMI3000 инъекций микроскопом </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinjector манипулятор (прямой привод) </td><td> Narashige ВС-3 Шарнир </td><td> Tritech исследований </td></tr><tr><td> Иглы Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech исследований </td></tr><tr><td> MicroInjector ™ Все-Digital Multi-давление в системе </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> Tritech исследований </td></tr><tr><td> GeneElute ™ млекопитающих Геномная ДНК Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> pJet Клонирование Jet комплект </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET плазмиды Miniprep комплект </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> Чистая ДНК и концентратор ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO исследований </td></tr><tr><td> БЛОК-IT ™ RNAi ТОПО ® транскрипции комплект </td><td> K3500-01-K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Агар Благородный </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Фишер Scientifi </td></tr><tr><td> Микроскоп покровного стекла (1,5 - 0,16 до 0.19mm толстый; Размер: 50 х 45 мм) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Стекло капилляров (нить) </td><td> 615000 </td><td> AM системы </td></tr><tr><td> Парафин нефти (жесткие) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

Хотя это и более доступными для новых модельных организмов для получения полной последовательности генома, дальнейшего углубленного функции гена и выражения анализов, РНК-интерференция и стабильной трансгенез остается ограниченным во многих видов из-за особенности анатомии и молекулярной клеточной биологии организма. Например, за пределами Caenorhabditis корону группа, которая включает Caenorhabditis Элеганс 3, стабильно передается трансгенных линий, не связанных с Caenorhabditis видов не было зарегистрировано в этом благовидный типу (нематод), за исключением Strongyloides stercoralis 4 и Pristionchus расШсиз 5. Чтобы облегчить расширение роли П. расШсиз в изучении развития, эволюции и поведения 6-7, мы описываем здесь современные методы использовать микроинъекции для создания трансгенных животных и генной сбить путем РНК-интерференции. Как гонад <em&gt; С. Элеганс и большинство других нематод, гонад P. расШсиз является syncitial и способных включения ДНК и РНК в ооцитах при доставке прямой микроинъекции. В отличие от С. Элеганс однако, стабильное наследование трансгенов и соматических выражение в П. расШсиз требует добавления собственной геномной ДНК переваривают эндонуклеазами дополнением к концам целевой трансгенов и инжекции маркеры 5. Кроме того носителя геномной ДНК похожа на требование для экспрессии трансгена в Strongyloides stercoralis 4 и в половых клетках C. Элеганс. Тем не менее, не ясно, если специальные требования для животных собственной геномной ДНК происходит потому, что П. расШсиз сома очень эффективно глушителей несложных мульти-копии генов или что внехромосомными массивы в P. расШсиз требуют геномных последовательностей для правильной сборки кинетохор во время митоза. Вентральной миграции двуруком (didelphic) гонад у гермафродитов еще более усложняет возможность вводить и половых желез в отдельных червей 8. Мы также демонстрируют использование микроинъекции в нокдаун доминирующим мутант (ролик, tu92) путем введения двухцепочечной РНК (дсРНК) в гонадах получить не-подвижного F 1 потомства. В отличие от С. Элеганс, но как и большинство других нематод, П. расШсиз PS312 не восприимчивы к системным RNAi через кормление и замачивания и, следовательно, дсРНК должны управлять микроинъекции в syncitial половых желез. В этом текущем исследовании, мы надеемся, чтобы описать процесс микроинъекции, необходимых для преобразования PPA-EGL-4 промоутера:: GFP репортер слияния и нокдаун доминирующим ролик ПРЛ-1 (tu92) мутант в визуально информативные протокола.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

В модельных организмов, трансгенез может манипулировать функций генов в то время как РНК-интерференции может нокдаун конкретных стенограммы мРНК 1-2. Этот протокол направлен на иллюстрации методов, необходимое для внедрения стабильно передается ДНК и переходные двухцепочечной РНК в necromenic нематоды<em&gt; Pristionchus расШсиз</em&gt; Для исследований в эволюционной, развития и поведенческих биологии.

RNAi опосредованного Нокдаун гена и трансгенез по Микроинъекция в Necromenic нематода Pristionchus расШсиз</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Локализованные RNAi и эктопической экспрессии гена в медицинской пиявки

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Бактериальные Доставка RNAi создания эффектов: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Активация апоптоза Цитоплазматическая Микроинъекция цитохрома С</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-опосредованной Нокдаун гена и<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ Диурез в взрослых женщин<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Комары

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода<em&gt; C. Элеганс</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...