Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00
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Los autores están muy agradecidos a RJ Sommer y Wang X para obtener ayuda con microinyección, así como de las perspicaces observaciones de los revisores anónimos. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención SC2GM089602.

1. Transgénesis: la preparación de ADN <ol><li> Dominante co-inyección marcador: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)] El pRL3 plásmido es un dominante co-inyección marcador para identificar visualmente los eventos exitosos de transformación. Este plásmido codifica para un alelo mutante dominante (tu92) del gen de la PPA-prl-1 estrechamente relacionado con el SQT-1 gen del colágeno en el C. elegans y transforma la locomoción sinusoidal de tipo salvaje en las aguj...

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	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

Las poblaciones de P. pacificus se encuentran en estrecha relación con varias especies de escarabajo en todo el mundo y es un modelo intermedio entre los nematodos de vida libre y nematodos parásitos. La fuerza de la P. pacificus como un organismo modelo emergente radica en la integración de sus mapas genéticos y físicos que promuevan la asignación de posición de los mutantes aislados imparcial pantallas adelante genéticos (es decir, no sólo por los genes candidatos previamen...

<table border="1"><tbody><tr><th> Producto: </th><th> Catálogo #: </th><th> Proveedor: </th></tr><tr><td> DMI3000 inyección microscopio </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinyector manipulador (transmisión directa) </td><td> Narashige BC-3 de rótula </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> Extractor de agujas </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> Microinyector ™ Todo-Digital Multi-La presión del sistema </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> GeneElute ™ mamíferos ADN genómico Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Jet kit de clonación </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plásmido kit Miniprep </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> ADN Clean &amp; Concentrador ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo Investigación </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® kit de transcripción </td><td> K3500-01 y K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Agar Difco ™ Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Scientifi </td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio (1,5 - 0,16 a 0.19mm de espesor, tamaño: 50 x 45 mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Capilares de vidrio (filamento) </td><td> 615000 </td><td> Los sistemas AM </td></tr><tr><td> Aceite de parafina (Heavy) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

A pesar de que es cada vez más asequibles para los organismos modelo emergente para obtener genomas secuenciados completamente, más a fondo la función de genes y análisis de expresión de ARN de interferencia y la transgénesis estable siguen siendo limitados en muchas especies debido a la anatomía particular y la biología molecular celular del organismo. Por ejemplo, en las afueras de la corona Caenorhabditis grupo que incluye Caenorhabditis elegans 3, de forma estable de transmisión en las líneas transgénicas no Caenorhabditis especies no han sido reportados en este phylum engañosa (Nematoda), con la excepción de Strongyloides stercoralis 4 y 5 Pristionchus pacificus. Para facilitar la ampliación del papel de P. pacificus en el estudio del desarrollo, la evolución y el comportamiento de 6-7, se describe aquí los métodos actuales para el uso de microinyección para la fabricación de animales transgénicos y knock por RNAi. Al igual que las gónadas de los <em&gt; C. elegans y la mayoría de otros nematodos, las gónadas de P. pacificus es sincitial y capaz de incorporar el ADN y ARN en los ovocitos cuando se entrega por microinyección directa. A diferencia de C. elegans Sin embargo, la herencia del transgén estable y la expresión somática en P. pacificus requiere la adición de ADN genómico digerido con endonucleasas auto complementario a los extremos de los transgenes blanco y marcadores coinyección 5. La adición de ADN genómico de transporte es similar a la necesidad de expresión del transgen en Strongyloides stercoralis 4 y en las células germinales de C. elegans. Sin embargo, no está claro si el requisito específico de ADN de los animales genómica propia se debe a P. pacificus soma es muy eficiente en el silenciamiento no complejos multi-copia genes o conjuntos de extracromosómico en P. pacificus requieren secuencias genómicas para el montaje adecuado cinetocoro durante la mitosis. La migración ventral de la (de dos brazosdidelphic) en las gónadas hermafroditas complica aún más la capacidad de inyectar ambas gónadas en los gusanos individual 8. También demostrar el uso de microinyección para derribar un mutante dominante (rodillo, tu92) mediante la inyección de ARN de doble cadena (dsRNA) en las gónadas para obtener información no rodar progenie F 1. A diferencia de C. elegans, pero como la mayoría de otros nematodos, P. pacificus PS312 no es receptiva a RNAi sistémico a través de la alimentación y el remojo y por lo tanto dsRNA debe ser administrado por microinyección en las gónadas sincitial. En este estudio, esperamos que para describir el proceso de microinyección necesarias para transformar un promotor PPA-EGL-4:: reportero GFP fusión y caída de un rodillo dominante prl-1 (tu92) mutante en un protocolo informativo visual.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

En organismos modelo, la transgénesis pueden manipular las funciones de genes, mientras que el ARNi puede caída transcripciones de ARNm específico de 1-2. Este protocolo tiene como objetivo ilustrar las técnicas necesarias para introducir ADN transmitido de forma estable y transitoria de ARN de doble cadena en el nemátodo necromenic<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Para los estudios de la biología evolutiva, de desarrollo y comportamiento.

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Localizada RNAi y la expresión génica ectópico en la sanguijuela medicinal

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Investigación

Biología

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Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

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Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

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Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

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Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

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El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...