Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

Författarna är mycket tacksamma till RJ Sommer och X Wang för hjälp med mikroinjektion, samt kommentarer insiktsfulla från den anonyma granskare. Detta arbete stöds av NIH bidrag SC2GM089602.

1. Genmodifiering: DNA-preparation <ol><li> Dominerande co-injektion markör: pRL3 [PPA-PRL-1 (tu92)] Den pRL3 plasmiden är en dominerande co-injektion markör för visuellt identifiera framgångsrika omvandling händelser. Denna plasmid kodar för en dominerande mutant allel (tu92) av PPA-PRL-1 genen nära samband med sqt-1 kollagen-genen i C. elegans och förvandlar wildtype sinusformade rörelseorganen i medurs vridning rörelser längs masken kropp axel...

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

P. pacificus populationer finns i nära samarbete med olika arter skarabé skalbagge över hela världen och är en modell nematod mellanting mellan fria levande och parasitiska nematoder. Styrkan i P. pacificus som en ny modell organism låg i integrationen av genetiska och fysiska kartor som främjar positionella kartläggning av mutanter isolerade från objektiva framåt genetiska skärmar (dvs. inte bara för kandidatgener tidigare karaktäriserat i C. elegans) 6,10. Me...

<table border="1"><tbody><tr><th> Produkt: </th><th> Catalog #: </th><th> Leverantör: </th></tr><tr><td> DMI3000 Injection mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinjector manipulator (Direkt enhet) </td><td> Narashige BC-3 Kulled </td><td> Tritech Forskning </td></tr><tr><td> Nål Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Forskning </td></tr><tr><td> MicroInjector ™ All-Digital Multi-trycksystem </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> Tritech Forskning </td></tr><tr><td> GeneElute ™ däggdjur Genomiskt DNA Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Kloning Jet kit </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plasmid Miniprep kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Concentrator ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO Forskning </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi Friluftskartan ® transkription kit </td><td> K3500-01 och K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher vetenskapligt </td></tr><tr><td> Mikroskop skyddsglas (1,5 - 0,16 till 0.19mm tjock, Storlek: 50 x 45mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Glas kapillärer (glödlampor) </td><td> 615 tusen </td><td> AM-system </td></tr><tr><td> Paraffinolja (tung) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

Även om det är allt överkomligt för nya modellorganismer för att få helt sekvenserade genom ytterligare fördjupad geners funktion och analyser uttryck genom RNA-interferens och stabil genmodifiering förblir begränsade i många arter på grund av särskilda anatomi och molekylär cellbiologi av organismen. Till exempel har utanför kronan gruppen Caenorhabditis som inkluderar Caenorhabditis elegans 3, stabilt överförs transgena linjerna i icke-Caenorhabditis arter som inte redovisats i denna bestickande fylum (Nematoda), med undantag för Strongyloides stercoralis 4 och Pristionchus pacificus 5. För att underlätta den växande roll P. pacificus i studien av utveckling, evolution och beteende 6-7, beskriver vi här de nuvarande metoderna att använda mikroinjektion för att göra transgena djur och genen slå ner med RNAi. Liksom gonaderna i <em&gt; C. elegans och de flesta andra nematoder, könskörtlarna av P. pacificus är syncitial och kan integrera DNA och RNA i ägg när de levereras av direkta mikroinjektion. Till skillnad från C. elegans dock stabil transgenen arv och somatiska uttryck i P. pacificus kräver tillsats av själv arvsmassans DNA kokas med endonukleaser komplement till ändarna på mål transgener och markörer coinjection 5. Tillägget av bärare arvsmassans DNA liknar kravet på transgenen uttryck i Strongyloides stercoralis 4 och i könsceller av C. elegans. Det är dock oklart om specifika krav för djurens egna arvsmassans DNA beror på s. pacificus Soma är mycket effektiv att tysta okomplicerade flera exemplar gener eller att extrakromosomala arrayer i P. pacificus kräver genomiska sekvenser för korrekt kinetochor montering under mitosen. Den ventrala migrering av två beväpnade (didelphic) gonaderna hermafroditer ytterligare komplicerar möjligheten att injicera både gonader i enskilda maskar 8. Vi visar också användningen av mikroinjektion att ÖVERVÄLDIGANDE en dominant mutation (rulle, tu92) genom att injicera dubbelsträngat RNA (dsRNA) i könskörtlarna att få icke-rullande F 1 avkomma. Till skillnad från C. elegans, men liksom de flesta andra nematoder, s. pacificus PS312 är inte mottaglig för systemisk RNAi via matning och blötläggning och därför dsRNA måste administreras genom mikroinjektion i syncitial gonaderna. I den här aktuella studien hoppas vi att beskriva mikroinjektion processen som behövs för att förvandla en PPA-EGL-4 promotorn:: GFP fusion reporter och ÖVERVÄLDIGANDE en dominerande roller PRL-1 (tu92) mutant i en visuellt informativa protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

I modellorganismer kan genmodifiering manipulera genfunktioner medan RNAi kan ÖVERVÄLDIGANDE specifika mRNA transkript 1-2. Detta protokoll syftar till att illustrera de tekniker som behövs för att införa stabilt överförs DNA och övergående dubbelsträngat RNA i necromenic nematoder<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; För studier i evolutionär, utvecklings-och beteendevetenskaplig biologi.

RNAi Medierad Gene Knockdown och genmodifiering genom mikroinjektion i Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Lokaliserad RNAi och ektopisk Gene Expression i läkemedlet Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Mikroinjektion av Zebrafish embryon till Analysera genfunktion

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Bakteriell Leverans av RNAi Effektenheter: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck test på Bomull

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated gene Knockdown och<em&gt; In Vivo</em&gt; Diures Analys hos vuxna kvinnliga<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Myggor

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletioner i<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Av High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Använda RNA-medierad strategi Interference Matning att screena för gener involverade i kroppsstorlek förordningen i rundmasken<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...