Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

Yazarlar mikroenjeksiyon yanı sıra anonim değerlendirenler anlayışlı görüşleri ile ilgili yardım için RJ Sommer ve X Wang müteşekkiriz. Bu çalışma NIH hibe SC2GM089602 tarafından desteklenmektedir.

1. Transgenesis: DNA hazırlığı <ol><li> Hakim ko-enjeksiyon belirleyicisi: pRL3 [Ppa-PRL-1 (tu92)] PRL3 plazmid görsel olarak başarılı bir dönüşüm olayları tanımlamak için, baskın bir ko-enjeksiyon belirteç . Bu plazmid yakından C. SQT-1 kolajen geni ile ilgili Ppa-PRL-1 geni baskın bir mutant allel (tu92) için kodlar elegans ve wild tip sinüzoidal lokomosyon solucan vücut ekseni 1,5 boyunca saat yönünde büküm hareketleri...

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

P. pacificus popülasyonları dünya çapında çeşitli bokböceği böcek türleri ile yakın ilişkisi bulunan ve serbest yaşayan ve paraziter nematod arasındaki ara bir model nematod . P. gücü gelişmekte olan bir model organizma olarak pacificus tarafsız ileri genetik ekranlarını izole mutantlar teşvik pozisyonel haritalama, genetik ve fiziksel haritalar entegrasyonu yatıyordu (yani sadece daha önce C. elegans karakterize aday genler için) 6,10. Anc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Ürün: </th><th> Katalog #: </th><th> Faaliyet alanı: </th></tr><tr><td> DMI3000 Enjeksiyon mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Mikroenjektör manipülatör (Direct drive) </td><td> Narashige BC-3 Rotil </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> İğne Çektirme </td><td> Narashige PC-10 </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> Mikroenjektör ™ All-Dijital Multi-basınç sistemi </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Memeli Genomik DNA Miniprep Seti </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Klonlama Jet kiti </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plazmid Miniprep kiti </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Konsantratörü ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO Araştırma </td></tr><tr><td> BLOK-IT ™ RNAi TOPO ® transkripsiyon kiti </td><td> K3500-01 ve K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher bilimsel </td></tr><tr><td> Mikroskop cam kapak (1.5 - 0,16 - 0,19 mm kalınlığında; Boyut: 50 x 45mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Cam kılcal damarlar (filament) </td><td> 615000 </td><td> AM sistemleri </td></tr><tr><td> Parafin Yağı (Ağır) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

RNA girişim ve istikrarlı transgenesis gen fonksiyonu ve ifade analizleri derinlemesine daha fazla, tamamen sıralı genomların elde birçok türün özellikle anatomi ve organizmanın moleküler hücre biyolojisi nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Gelişmekte olan model organizmalar için gittikçe daha uygun fiyatlı olmasına rağmen Örneğin, stably Caenorhabditis olmayan türlerin transgenik hatları bulaşan Caenorhabditis elegans 3, taç grup Caenorhabditis dışında Strongyloides stercoralis 4 ve Pristionchus pacificus 5 istisna ile, bu aldatıcı filumun (Nematoda) bildirilmiştir değil. P. genişleyen rolünü kolaylaştırmak için çalışmada, gelişme, evrim, ve davranış 6-7 pacificus, biz burada, transgenik hayvanlar ve gen RNAi tarafından yıkmak yapmak için mikroenjeksiyon kullanmak için geçerli yöntemleri açıklanmaktadır. Gonadlar gibi <em&gt; C. elegans ve diğer birçok nematod, P. gonadlar pacificus syncitial ve doğrudan mikroenjeksiyon tarafından teslim oosit içine DNA ve RNA içeren yeteneğine sahip. C. aksine P. de elegans Ancak, istikrarlı transgen miras ve somatik ifade pacificus hedef transgenlerin ve coinjection belirteçler 5 biter tamamlayıcı endonükleaz ile sindirilir kendini genomik DNA eklenmesini gerektirir. Ayrıca taşıyıcı genomik DNA Strongyloides stercoralis 4 ve C germ hücreleri transgen ifade gereksinimi için benzer elegans. Ancak, bu hayvanların kendi genomik DNA için spesifik bir gereklilik ise açık değildir, çünkü P. pacificus soma karmaşık olmayan çok kopyalı genlerin susturulması ya da çok verimli P. içinde ekstrakromozomal diziler pacificus mitoz sırasında uygun kinetochore montaj için genomik dizileri gerektirir. Iki kollu (ventral göççift ​​cinsiyetli olarak didelphic) gonadlar, bireysel solucanlar 8 hem de gonadlar enjekte yeteneği daha da zorlaştırmaktadır. Ayrıca demonte haddeleme olmayan F 1 döl elde etmek için çift iplikli RNA (dsRNA) gonadlar içine enjekte edilerek baskın bir mutant (rulo, tu92) mikroenjeksiyon kullanımı göstermektedir. C. aksine elegans, ancak diğer pek çok nematod gibi, P. pacificus PS312 besleme ve iliklerine ve bu nedenle dsRNA syncitial gonadlar içine mikroenjeksiyon tarafından uygulanmalıdır yoluyla sistemik RNAi açık değildir. Bu çalışmada, biz Ppa-egl-4 organizatörü dönüştürmek için gerekli olan mikroenjeksiyon işlemi tanımlamak için umut: GFP füzyon muhabir ve demonte baskın bir rulo PRL-1 (tu92) mutant görsel bilgilendirici bir protokoldür.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi spesifik mRNA transkript 1-2 demonte model organizmalar, transgenesis gen işlevleri işleyebilirsiniz. Bu protokol, necromenic nematod içine stably iletilen DNA ve geçici çift iplikli RNA tanıtmak için gerekli teknikleri göstermek için hedefliyor<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;, Evrimsel gelişim ve davranış biyolojisi çalışmaları için.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Lokalize RNAi ve Tıbbi Sülük Ektopik Gen İfadesi

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNAi Efektör Bakteriyel Teslim Tarihi: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...