Name: efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

وقد تم دعم XHP بواسطة المعهد الوطني للمنح (NIH) الصحة من المعهد الوطني للشيخوخة (NIHK01AG024496) يونيس كينيدي وشرايفر المعهد القومي لصحة الطفل والتنمية البشرية (NIHR21HD056530).

1. الحل وإعداد وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل طلاء الجيلاتين : 0.1 ٪ (ث / ت) الجيلاتين في DDH 2 O ، تعقيمها وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Matrigel حلول الطلاء. محلول المخزون : تحسن بطيء Matrigel (10 مل) في 4 درجات مئوية خلال الليل ، إضافة 10 مل من الجليد الباردة أو DMEM DMEM/F12 ، تخلط جيدا وقسامة 1 مل / أنبوب تعقيم الأنسجة تحت غطاء محرك السيارة والثقافة ، ومخزن في -20 درجة مئوية. يعمل الحل : 1 تحسن بطيء قسامة Matrigel مل عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات ، ونقل إلى 14 مل أو مبردة DMEM DMEM/F12 وتخلط جيدا تعقيم الأنسجة تحت غطاء الثقافة مباشرة قبل الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنسان حل طلاء laminin : 1 مل تمييع الحل laminin الإنسان (0.5 ملغ / مل في تريس التخزين المؤقت كلوريد الصوديوم ، وتخزينها في -80 درجة مئوية ، وتحسن بطيء في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة) مع الثلج الباردة DMEM أو لDMEM/F12 12.5 مل محلول العمل (40 ميكروغرام / مل) تحت غطاء الثقافة تعقيم الأنسجة مباشرة قبل الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول نمو المخزون عامل (500 - 1000X) : حل عامل النمو بنسبة 10 ميكروغرام/ مل في تعقيم العازلة (0.5 ٪ BSA ، 1.0 ملي DTT ، الجلسرين 10 ٪ ، 1XPBS) والمخزن كما aliquots ميكروليتر / 50-100 في أنبوب -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل العابرة للحمض الريتينويك عامل الحل (1000X) : 10 مم في DMSO ، في مخزن في aliquots -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الاعلام HESC : DMEM/F12 أو KO - DMEM (80 ٪) ، KO استبدال المصل (20 ٪) ، L - ألانيل GLN - L - L - GLN أو (2 ملم) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (MNAA ، 1X) ، و β - المركابتويثانول (100 ميكرون) وتصفيتها وتخزينها في 4 درجات مئوية ، على أن تستكمل مع bFGF نانوغرام / مل 20 قبل استخدامها. أو الاستعاضة عن عبارة &quot;ضرب (KO) استبدال المصل&quot; مع عناصر محددة : DMEM/F12 أو KO - DMEM (100 ٪) ، L - ألانيل GLN - L - L - GLN أو (2 ملم) ، MNAA (1X) ، MEM الأساسية الأحماض الأمينية (MEAA ، 1X) ، وβ - المركابتويثانول (100 ميكرون) وتصفيتها وتخزينها في 4 درجات مئوية ، على أن تستكمل مع bFGF (20 نانوغرام / مل) ، الأنسولين البشري (20 ميكروغرام / مل) ، وحمض الاسكوربيك (50 ميكروغرام / مل) ، والإنسان activin (50 نانوغرام / مل) ، والبشرية Albumax ألبومين / (10 ملغ / مل) ، وترانسفيرين الإنسان (8 ميكروغرام / مل) قبل الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجلس الأمن القومي وسائل الإعلام : DMEM/F12 (100 ٪) ، N - 2 supplemeNT (1X) والهيبارين (8 ميكروغرام / مل). </li></ol> 2. لوحة طلاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات معطف مع الجيلاتين : إضافة 2.5 مل / بئر حل الجيلاتين إلى 6 لوحات جيدة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة مرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> gelatinized البرد الجيلاتين المغلفة لوحات وإزالة الجيلاتين ، إضافة 2.5 مل / Matrigel الإنسان جيدا أو حل طلاء laminin مبردة تعمل على مرحلة ما قبل 6 لوحات وكذلك احتضان عند 4 درجات مئوية ليلا : لوحات معطف مع laminin. </li></ol> 3. الركض والبذر hESCs غير متمايزة في ظل ظروف محددة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتنمو المستعمرات hESC 5-7 أيام من العمر ، واتخاذ hESC الثقافة لوحة مجهر تشريح (ما قبل المرحلة الدافئة تشريح إلى 37 درجة مئوية) تحت غطاء محرك السيارة تشريح تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد لتقسيم المستعمرات hESC. شكليا ، ينبغي لهذه المستعمرات و&gt; hESCs غير متمايزة 75 ٪ (الخلايا المدمجة الصغيرة) ، وعادة مبهمة قليلا (وليس أبيض مكدسة المتابعة الخلايا ، وليس واضحا عن اختلاف الخلايا) مع برنامج الأمم المتحدة حافة محددةderneath المجهر تشريح. مخطط بعناية المستعمرات المختارة وإزالة طبقة الخلايا الليفية المحيطة متباينة المستعمرة ، وجميع أجزاء متمايزة (إن وجدت) من مستعمرة مع حافة الحافة P2 ماصة معقمة أو سحب الزجاج الشعرية. (يرجى ملاحظة ، hESCs المحفزة هي في مرحلة عابرة ، الخضوع التمايز عفوية حتى في ظل أفضل الظروف ، على الرغم من المفضل ، من الصعب على الخلايا الأطروحات التأكد بنسبة 100 ٪ غير متمايزة تحت مجهر تشريح ،&gt; 75 ٪ وتعتبر عادة غير متمايزة كنقطة تمرير ، و خلايا متمايزة عادة لن البذور وتستمر في النمو ، في عملية القضاء على الركض) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام القديمة التي تحتوي على خلايا متمايزة منفصلة عائمة بواسطة الشفط. تغسل مع وسائل الاعلام hESC (بدون bFGF) مرة واحدة. أضف 3 مل / وسائل الإعلام hESC الطازجة جيدا تحتوي على 20 نانوغرام / مل bFGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المستعمرات hESC غير متمايزة الى قطع صغيرة ، وفصل مع تلميح ماصة معقمة أو الزجاج سحبت الشعرية.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على قطع مستعمرة منفصلة معا في أنبوب مخروطية 50 مل. غسل لوحة واحدة مع 1 مل / وسائل الإعلام hESC كذلك تحتوي على 20 نانوغرام / مل bFGF وحمام سباحة معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في Matrigel أو حل laminin الإنسان من الصفائح الطازجة المغلفة. قسامة 4 وسائل الاعلام hESC مل / جيدا تحتوي على قطع مستعمرة لوحة 6 - جيدا. نقل بلطف لوحة الحاضنة دون أن تهتز والسماح مستعمرة قطعة البذور بين عشية وضحاها من دون إزعاج في ترطيب 37 درجة مئوية مع حاضنة جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2. </li></ol> 4. العصبية تحريض hESCs بموجب نظام محدد الثقافة مع حمض الريتينويك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 بعد الغرس وإزالة معظم وسائل الإعلام القديمة من كل بئر من لوحة وترك وسائل الاعلام بما فيه الكفاية للسماح للمستعمرات hESC أن تكون مغمورة (hESCs تسمح ابدا لتجف). استبدال 4 مل / وسائل الإعلام hESC الطازجة جيدا تحتوي على 20 نانوغرام / مل و 10 bFGF ميكرومتر حمض الريتينويك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال القديم مع وسائل الاعلام وسائل الاعلام hESC الطازجة تحتوي على 20 نانوغرام / مل وbFGF10 ميكرومتر حمض الريتينويك كل يوم ، والسماح للمستعمرات hESC العصبية الناجمة عن النمو ليوم 7 أو 8. سوف كافة الخلايا داخل المستعمرة تغيرات مورفولوجية لخلايا متمايزة الكبيرة التي سوف تستمر في التكاثر. فإن الزيادة في حجم المستعمرات لتغطية لوحة من قبل يوم 7 أو 8 ، وسوف تبدأ الخلايا تتراكم في بعض المناطق في المستعمرات. </li></ol> 5. متعلق بالخلايا العصبية التمايز المستمر في الثقافة تعليق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ لوحة hESC الثقافة تشريح المجهر (ما قبل المرحلة الدافئة تشريح إلى 37 درجة مئوية) تحت غطاء محرك السيارة تشريح تعقيمها. مخطط بعناية المستعمرات وإزالة طبقة الخلايا الليفية المحيطة مستعمرة (خلايا متمايزة هاجروا من مستعمرة) مع حافة الحافة P2 ماصة معقمة أو سحب الزجاج الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام القديمة التي تحتوي على الخلايا الليفية عائمة منفصلة بواسطة الشفط. تغسل مع وسائل الاعلام hESC (بدون bFGF) مرة واحدة. أضف 3 مل / وسائل الإعلام hESC الطازجة جيدا (بدون bFGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع العصبية ، طسحبت المستعمرات hESC nduced الى قطع صغيرة ، وفصل مع تلميح ماصة معقمة أو الزجاج الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على قطع مستعمرة منفصلة معا في أنبوب مخروطية 50 مل. غسل لوحة واحدة مع 1 مل / وسائل الإعلام hESC جيدا (بدون bFGF) ، وتجمع معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 4 مل / مصل hESC جيدا وسائل الإعلام التي تحتوي على قطع خالية من مستعمرة إلى لوحة ultralow مرفق 6 جيدا واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مرطب للسماح للكتل عائمة الخلوية (neuroblasts) لتشكيل ل4-5 أيام. </li></ol> 6. النمط الظاهري العصبية نضوج في الثقافة لاصق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على neuroblasts العائمة معا في أنبوب مخروطية 50 مل. 1400 دورة في الدقيقة في أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. نضح في وسائل الإعلام القديمة بقدر ما تستطيع ، وإضافة كمية مساوية من وسائل الاعلام NSC الطازجة التي تحتوي على VEGF (20 نانوغرام / مل) ، NT - 3 (10 نانوغرام / مل) ، وعامل التغذية العصبية الدماغي (10 نانوغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة صعودا وهبوطا لخلط neuroblasts العائمة وقسامة 4 مل / إضافة إلى 6 لوحات جيدا. يمكن أيضا أن تكون ذاتها neuroblastseded في بلمرة laminin laminin / الكولاجين (Matrigel) أو الإنسان 3 الابعاد مصفوفة في وسائل الإعلام NSC المصل خالية VEGF تحتوي على (20 نانوغرام / مل) ، NT - 3 (10 نانوغرام / مل) ، وعامل التغذية العصبية الدماغي (10 نانوغرام / مل) . نقل لوحات إلى 37 درجة مئوية حاضنة مرطب للسماح لإرفاق neuroblasts بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحل محل مجلس الأمن القومي وسائل الإعلام التي تحتوي على VEGF (20 نانوغرام / مل) ، NT - 3 (10 نانوغرام / مل) ، وعامل التغذية العصبية الدماغي (10 نانوغرام / مل) كل يوم. وشبكات واسعة من neurite تحمل الخلايا العصبية والخلايا الصباغية تبدأ في الظهور في غضون 2 أسابيع من زراعة ومستمر وزيادة في أعداد مع مرور الوقت ، ويمكن أن يستمر لأكثر من 3 شهور. </li></ol> 7. ممثل النتائج : يتم تقديم حمض الريتينويك (RA) كافية للحث على المحافظة على hESCs في نظام المعرفة لثقافة الانتقال من تعدد القدرات حصرا إلى النمط الظاهري الأديم العصبي الظاهر (الشكل 2A). عند التعرض للhESCs غير متمايزة لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، وجميع الخلايا داخل المستعمرة تغيرات مورفولوجية لخلايا متمايزة الكبيرة التي وقف التعبير عن تعدد القدرات المرتبطة علامات ، كما يتبين من أكتوبر - 4 ، والبدء في التعبير عن مختلف neuroectoderm المرتبطة علامات ، مثل HNK1 ، AP2 وTrkC (الشكل 2B). وهذه الخلايا الكبيرة المتباينة مواصلة ضرب والمستعمرات وزيادة في حجمها ، والشروع بشكل عفوي للتعبير عن علامة مبكرة العصبية β - III - تويولين (الشكل 2B). وعلامة أكثر نضجا العصبية خريطة - 2 تبدأ في الظهور في مناطق المستعمرات حيث تراكمت الخلايا (الشكل 2B). تتزامن مع ظهور الخلايا العصبية الأديم العصبي الظاهر والتمايز ، فإن الخلايا العصبية عامل الترانسكربتي Nurr1 محددة ، المتورطين في تمايز الخلايا العصبية الدوبامين وتفعيل هيدروكسيلاز التيروزين (TH) الجين 16 ، نقل من مكان لآخر إلى النواة (الشكل 2B). بعد فصل ، فإن hESCs RA - تعامل شكل كتل عائمة الخلوية (neuroblasts) في عبادة تعليقلدى عودتهم إلى مواصلة عملية التمايز العصبية. عند إزالة bFGF وبعد السماح لإرفاق neuroblasts نسيج لوحة الثقافة أو المصنفة في بلمرة laminin / 3 الكولاجين الأبعاد مصفوفة في المتوسط ​​خالية من المصل محددة ، β - III - تويولين وخريطة - 2 - الإعراب ، neurite وتحمل الخلايا والخلايا الصباغية تبدأ في الظهور مع زيادة كبيرة في كفاءة بالمقارنة مع النسب التمايز المتعدد عفوية من دون علاج hESCs على مدى الفترة الزمنية نفسها ، ويمكن أن يستمر لأكثر من 3 شهور (الشكل 2C). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> الشكل 1 تخطيطي جيدا التعريفي للرقابة فعالة من خلايا الجذعية المحفزة حصرا على نسب معينة سريريا ذات الصلة عن طريق توفير بسيط من الجزيئات الصغيرة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> الشكل 2 <stroنانوغرام&gt; حمض الريتينويك يدفع العصبية مواصفات الانساب وتطور الخلايا العصبية مباشرة لتعدد القدرات في ظل ظروف محددة. (A) التي تصور تخطيطي للبروتوكول خط وقت تمايز الخلايا العصبية الموجهة من hESCs. (ب) عند التعرض لhESCs غير متمايزة لحمض الريتينويك (RA) في إطار منظومة ثقافة محددة ، واسعة متباينة - 4 أكتوبر بدأت (أحمر) خلايا السلبية داخل مستعمرة في الظهور ، مقارنة hESCs (DMSO) وهمية ، تعامل على أنها عنصر التحكم . RA - المستحث بدأت خلايا متمايزة أكتوبر - 4 - السلبية للتعبير عن HNK - 1 (الحمراء) ، AP2 (الحمراء) ، TrkC (الأخضر) ، ثم β - III - تويولين (الحمراء) ، بما يتفق مع تمايز الأديم العصبي الظاهر في وقت مبكر. استمرت هذه الخلايا إلى أن تنضج في النهاية تعبير عن علامة العصبية خريطة - 2 (الأخضر) ، وعادة في المناطق التي بدأت الخلايا تتراكم. تتزامن مع ظهور الخلايا العصبية الأديم العصبي الظاهر والتمايز ، ومحددة الترانسكربتي العصبية Nurr1 عامل (الأخضر) ، المتورطين فيتمايز الخلايا العصبية الدوبامين وتفعيل هيدروكسيلاز التيروزين (TH) الجينات ، translocated إلى النواة. وتظهر جميع الخلايا تلطيخ دابي من النواة (الأزرق). (C) RA العلاج يدفع نحو تمايز الخلايا العصبية مع نسب عالية الكفاءة والمقدرة من قبل شبكات واسعة من الخلايا الحاملة للneurite معربا عن β - III - تويولين (الحمراء) ، وخريطة - 2 (الأخضر ، كما هو موضح في مصفوفة 3 dimentional). تشير الأسهم إلى الخلايا الصباغية نموذجية من تلك الموجودة في الجهاز العصبي المركزي. وتظهر جميع الخلايا تلطيخ دابي من النواة (الأزرق) في insets. أشرطة النطاق : 0.1 مم.

<ol>
	<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+improvement+in+a+primate+Parkinson's+model+is+associated+with+multiple+homeostatic+effects+of+human+neural+stem+cells.">Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).</li><li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells.">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nature Rev. 7, 395-406 (2006).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Br&#252;stle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage.">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain. Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., S&#252;dhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

الكتاب تعلن المصالح المتنافسة. XHP هو مؤسس Xcelthera. XHP EYS ولها خصائص الفكرية المتصلة hESCs.

كان واحدا من التحديات الكبرى على حد سواء دراسة تنموية والترجمة السريرية كيفية توجيه إمكانات واسعة من تمايز الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان إلى النمط الظاهري المطلوب بكفاءة ويمكن التنبؤ به. على الرغم من أن مثل هذه الخلايا يمكن التفريق بصورة عفوية إلى خلايا في المختبر من كل الطبقات الجرثومية التي تمر في مرحلة تجميع متعددة النسب ، سوى جزء صغير من الخلايا اتباع 1،4 نسب معينة. في تلك المجاميع hESC المشتقة ، وظهور المتزامن لكمية كبيرة من اختلاف أنواع الخلايا غير المرغوب فيها على نطاق واسع قد تكون موجودة في ثلاث طبقات جرثومية جنينية غالبا ما يجعل ظهور الظواهر المطلوب ليس فقط غير فعالة ، ولكن لا يمكن السيطرة عليها ولا يمكن الاعتماد عليها كذلك. على الرغم من أن استمدت الأنساب القلب والعصبية في التقارير السابقة ، ومع ذلك ، فإن عدم الكفاءة في توليد الخلايا المتخصصة من خلال تحريض الجرثومية طبقة من الخلايا المحفزة ومخاطر عالية من tumorigenicity التالية transplantatioن الترجمة أعاقت المزيد من السريرية. خطوط hESC في البداية كانت تستمد والمحافظة عليها في الثقافة بالتعاون مع نمو الخلايا الليفية القبض على الفأر الجنينية (MEFs) 4. وإن كانت قد وضعت عدة تغذية الإنسان ، التغذية الحرة ، ونظم الثقافة كيميائيا وضعت لhESCs 11-13 ، تبقى دون حل العناصر الضرورية والكافية للحفاظ على الذات تجديد الخلايا المحفزة الإنسان. هذه الخلايا المغذية الخارجية والكواشف البيولوجية مساعدة في الحفاظ على نمو مستقر على المدى الطويل من hESCs غير متمايزة في حين تحجب قدرة الخلايا المحفزة على الاستجابة لإشارات التنموية. الحفاظ على hESCs غير متمايزة في نظام محدد الثقافة البيولوجية الخالية من المؤمنين بأن يسمح التوسع والسيطرة المباشرة التمايز هو واحد من مفاتيح لفائدتها العلاجية والمحتملين. وكان RA يست كافية للحث على تمايز الخلايا العصبية من hESCs غير متمايزة في إطار الحفاظ على كونديت ذكرت سابقاالأيونات التي تحتوي على الخلايا المغذية الخارجية. على الرغم من الأنساب العصبية تظهر في مرحلة مبكرة نسبيا في التفريق hESC ، وعلاج hESC عن اختلاف نسب مجاميع متعددة (الهيئات مضغي الشكل) مع RA قليلا فقط زيادة العائد المنخفض من الخلايا العصبية 1 ، 14 ، 15. استخدمنا من أجل تحقيق تحويل موحد للخلايا الجذعية المحفزة لنسب معينة ، وهو نظام قادر على تعريف الثقافة تأمين انتشار hESCs غير متمايزة لتحديد الظروف التي تسيطر عليها بشكل جيد للتحريض كفاءة hESCs المحفزة حصرا على وجه الخصوص النسب ذات الصلة سريريا عن طريق توفير بسيط من الجزيئات الصغيرة (الشكل 1 ، الشكل 2). وسوف تكشف الدراسات المستقبلية مراقبة الجزيئات الجينية وجينية في مجال التنمية البشرية CNS كبدائل ، والتي قد تمهد الطريق للسيطرة على جزيء صغير بوساطة مباشرة والتشكيل مصير المحفزة hESC عند اشتقاق الأنساب سريريا ذات الصلة لعلاجات التجدد. من دون علاج التهاب المفاصل الروماتويدي ، 1-5وسوف يخضع hESCs ٪ التمايز عفوية إلى خلايا عصبية 1 ، 14 ، 15. مع علاج التهاب المفاصل الروماتويدي ، كنا قادرين على توليد&gt; 95 ٪ أسلاف الخلايا العصبية الجنينية والخلايا العصبية من hESCs حافظت ظل ثقافة تحدد في العملية التي قد تحاكي التطور الجنيني البشري 14. في الآونة الأخيرة ، استخدمت يعرف مصير العصبية تحديد الجينات إلى الخلايا الليفية transdifferentiate الماوس إلى الأسلاف الكبار العصبية والخلايا العصبية مع انخفاض كفاءة تتراوح بين 0،5-8 ٪ 17 و 18. ومع ذلك ، فقد تم إعادة برمجة الخلايا تاريخيا الجسدية المرتبطة الشاذ التعبير الجيني وتسارع الشيخوخة مع فائدة علاجية ضعاف 19-21. أخيرا قد يقتصر البروتوكول أسسنا هنا لhESCs المحفزة المستمدة من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) أو الأديم الظاهر من الكيسة الإنسان 4 ، لا ينطبق على الخلايا المحفزة الأخرى ، بما فيها المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، نشأت المجالس الاقتصادية والاجتماعية الحيوانية المستمدة من morula في وقت سابق (ثمانية خلية) في مرحلة الأجنة 22 ، وartifإعادة برمجة الخلايا icially 23.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليق (اختياري) </th></tr><tr><td> الجيلاتين </td><td> سيغما </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> العلوم الحيوية دينار بحريني </td><td> 356231 </td><td> انخفاض عامل النمو </td></tr><tr><td> الإنسان laminin </td><td> سيغما </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> كل العابرة للحمض الريتينويك </td><td> سيغما </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM - KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> خروج المغلوب استبدال المصل </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM غير الضرورى حل الأحماض الأمينية (MNAA ، 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aمينو الأحماض الحل (MEAA ، 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الاسكوربيك </td><td> سيغما </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان ترانسفيرين </td><td> سيغما </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF - 100 - 18B </td><td></td></tr><tr><td> الأنسولين البشري </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120 - 14E </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF - 450-02 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF - 100-20 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان NT - 3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> الهيبارين </tد&gt; <td> سيغما </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2 الملحق (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6 كذلك لوحة ultralow مرفق </td><td> كورنينج </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 كذلك لوحة </td><td> كورنينج </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

أقمنا على بروتوكول لتحريض مباشر من neuroblasts المحفزة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في ظل ظروف محددة المحافظة مع الجزيئات الصغيرة ، والتي تمكن من اشتقاق كميات كبيرة من الخلايا العصبية أسلاف الإنسان وأنواع الخلايا العصبية الخلية في الجهاز العصبي المركزي النامية لإصلاح العصبية.

كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

زرع تحت الشبكية لأنسجة الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في نموذج حيواني كبير للقطط

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة في الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشبك البشري

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...