Name: efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

XHP er blevet støttet af National Institute of Health (NIH) tilskud fra National Institute on Aging (NIHK01AG024496) og The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

1. Løsning og medier Forberedelse <ol><li> Gelatine belægning løsning: 0,1% (w / v) gelatine i Hedeselskabet 2 O, autoklaveres og opbevares ved 4 ° C. </li><li> Matrigel coating løsninger. Stamopløsning: langsom optøning Matrigel (10 ml) ved 4 ° C natten over, tilsæt 10 ml iskold DMEM eller DMEM/F12, bland godt og alikvot 1 ml / rør nedenunder steriliseret vævskultur hætte, opbevares ved -20 ° C. Arbejde løsning: langsom optøning 1 ml Matrigel alikvot ved 4 ° C i 1-2 timer, overføres til 14 ml kølet DMEM eller DMEM/F12 og bland det godt nedenunder steriliseret vævskultur hætte umiddelbart før belægning. </li><li> Menneskelige laminin belægning opløsning: 1 ml human laminin opløsning (0,5 mg / ml i Tris buffered NaCl, opbevares ved -80 ° C, langsomt tø op ved 4 ° C i 1-2 time) med iskolde DMEM eller DMEM/F12 til 12,5 ml brugsopløsning (40 mg / ml) under steriliseret vævskultur hætte umiddelbart før belægning. </li><li> Vækstfaktor stamopløsninger (500-1000x): opløses vækstfaktor på 10 mikrogram/ Ml i steriliseret buffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycerol, 1XPBS) og gemmes som 50-100 μl / rør alikvoter ved -80 ° C. </li><li> All-trans-retinsyre arbejdsopløsning (1000x): 10 mM i DMSO, opbevares i alikvoter ved -80 ° C. </li><li> HESC medier: DMEM/F12 eller KO-DMEM (80%), KO serum udskiftning (20%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MEM uvæsentlige aminosyrer (MNAA, 1X), og β-mercaptoethanol (100 mM), filtreres og opbevares ved 4 ° C, suppleret med 20 ng / ml bFGF før brug. Eller udskiftning af &quot;knock out (KO) serum udskiftning&quot; med definerede komponenter: DMEM/F12 eller KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM afgørende aminosyrer (MEAA, 1X), og β-mercaptoethanol (100 mM), filtreres og opbevares ved 4 ° C, suppleret med bFGF (20 ng / ml), human insulin (20 mg / ml), askorbinsyre (50 mg / ml), menneskelige activin A (50 ng / ml), human albumin / Albumax (10 mg / ml), og menneskelige transferrin (8 mg / ml) før brug. </li><li> NSC medier: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), heparin (8 mg / ml). </li></ol> 2. Plate Coating <ol><li> Coat plader med gelatine: Tilsæt 2,5 ml / hul gelatine løsning til 6 samt plader og inkuber natten over i et 37 ° C fugtet inkubator. </li><li> Coat plader med laminin: chill gelatine-plader og fjerne gelatine, tilsættes 2,5 ml / hul Matrigel eller menneskelige laminin belægning brugsopløsning til at pre-kølet gelatinized 6-godt plader og inkuberes ved 4 ° C natten over. </li></ol> 3. Passaging og såning Private husholdningers hESCs under definerede betingelser <ol><li> Tillad hESC kolonier vokse til 5-7 dage gamle, og tage hESC agarplade til dissektionsmikroskop (præ-varme dissekere fase til 37 ° C) under dissekering steriliseret hætte. </li><li> Vælg hESC kolonier skal opdeles. Morfologisk, bør disse kolonier er&gt; 75% udifferentierede hESCs (små kompakte celler), som regel svagt uigennemsigtig, (ikke hvid-opstablede celler, ikke klart-opdelte celler) med definerede kant underneath den dissektionsmikroskop. Omhyggeligt skitsere de udvalgte kolonier og fjerne differentieret fibroblast lag omkring koloni og alle differentierede dele (hvis nogen) i kolonien med kanten af ​​P2 steril pipette spids eller trukket glas kapillar. (Bemærk, pluripotente hESCs er på en forbigående fase, gennemgå spontan differentiering selv under optimale betingelser, men foretrak, at det er vanskeligt at fastslå, afhandlinger celler er 100% udifferentierede under dissektionsmikroskop,&gt; 75% udifferentierede er normalt betragtes som passerer punkt. differentierede celler vil normalt ikke frø og fortsætte med at vokse, elimineret i passaging processen) </li><li> Fjern de gamle medier, der indeholder flydende løsrevne differentierede celler ved sugning. Vask med hESC medier (uden bFGF) én gang. Tilsæt 3 ml / hul frisk hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF. </li><li> Skær udifferentierede hESC kolonier i små stykker, og tag med steril pipette spids eller trukket glas kapillar.</li><li> Pool medierne indeholder fritliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk rør. Vask pladen en gang med 1 ml / hul hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF og samle. </li><li> Aspirer den Matrigel eller mennesker laminin løsning fra det coatede friske plader. Alikvot 4 ml / hul hESC medier, der indeholder koloni brikker til et 6-brønds plade. Forsigtigt overføre pladen til inkubator uden at ryste, og lad koloni stykker frø natten uden at forstyrre i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære på 5% CO 2. </li></ol> 4. Neural Induktion af hESCs under definerede kultur System med retinsyre <ol><li> På dag 3 efter såning, fjerne de fleste af de gamle medier fra hver brønd af pladen og lad nok medier til at tillade hESC kolonier at blive oversvømmet (aldrig tillade hESCs at tørre ud). Udskift med 4 ml / hul frisk hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF og 10 ìm retinsyre. </li><li> Udskift gamle medier med frisk hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF og10 ìm retinsyre hver anden dag, og lad neurale-induceret hESC kolonier vokse til dag 7 eller 8. Alle celler i kolonien vil undergå morfologi ændringer i store differentierede celler, der vil fortsætte med at formere sig. Kolonierne vil stige i størrelse til at dække pladen ved dag 7 eller 8, og celler vil begynde at hobe sig op i nogle områder af kolonierne. </li></ol> 5. Fortsat Neuronal Differentiering i suspension kultur <ol><li> Tag hESC agarplade til dissektionsmikroskop (præ-varme dissekere fase til 37 ° C) under dissekering steriliseret hætte. Forsigtigt skitsere de kolonier og fjern fibroblast lag omkring koloni (differentierede celler migreret ud af koloni) med kanten af ​​P2 steril pipette spids eller trukket glas kapillar. </li><li> Fjern de gamle medier, der indeholder flydende løsrevne fibroblastceller ved sugning. Vask med hESC medier (uden bFGF) én gang. Tilsæt 3 ml / hul frisk hESC medier (uden bFGF). </li><li> Skær neurale-induced hESC kolonier i små stykker, og tag med steril pipette spids eller trukket glas kapillar. </li><li> Pool medierne indeholder fritliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk rør. Vask pladen en gang med 1 ml / hul hESC medier (uden bFGF) og samle. </li><li> Alikvot 4 ml / hul serumfrit hESC medier, der indeholder koloni brikker til et 6-vel ultralow vedhæftet pladen og inkuber i et 37 ° C fugtet inkubator for at tillade flydende cellulære klynger (neuroblasts) til at danne i 4-5 dage. </li></ol> 6. Neuronal Fænotype modning i Adhesive Kultur <ol><li> Pool de medier, der indeholder flydende neuroblasts sammen i en 50 ml konisk rør. Centrifuger ved 1400 rpm i 5 min. Aspirer de gamle medier så meget som du kan og tilføje lige mængden af ​​frisk NSC medier, der indeholder VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), og BDNF (10 ng / ml). </li><li> Pipette op og ned for at blande flydende neuroblasts og alikvot 4 ml / hul til 6-godt plader. Den neuroblasts kan også seeded i en laminin / kollagen (Matrigel) eller menneskers laminin polymeriseret 3-dimensionel matrix i serumfrit NSC medier, der indeholder VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), og BDNF (10 ng / ml) . Overførsel pladerne til en 37 ° C fugtet inkubator for at tillade neuroblasts at vedhæfte natten over. </li><li> Udskift NSC medier indeholdende VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), og BDNF (10 ng / ml) hver anden dag. Omfattende netværk af neurite-bærende neuronale celler og pigmenterede celler vil begynde at dukke op inden for 2 uger kontinuerlig dyrkning og stigning i antallet med tiden, og kunne opretholdes i over 3 måneder. </li></ol> 7. Repræsentative resultater: Retinsyre (RA) er gjort tilstrækkelig til at fremkalde hESCs bibeholdes i den definerede kultur-systemet til at skifte fra pluripotency udelukkende til en neuroectodermal fænotype (Fig. 2A). Ved eksponering af udifferentieret hESCs til RA, vil alle celler i kolonien gennemgå morfologi ændringerstore differentierede celler, der ophører med at udtrykke pluripotency-associeret markører, som det fremgår af oktober-4, og begynde at udtrykke forskellige neuroectoderm-associerede markører, såsom HNK1, AP2, og TrkC (Fig. 2B). Disse store differentierede celler vil fortsætte med at formere sig og kolonierne vil stige i størrelse, fortsætter spontant at udtrykke de tidlige neuronale markør β-III-tubulin (Fig. 2B). Jo mere modne neuronal markør Kort-2 vil begynde at dukke op i områder af kolonier, hvor cellerne har hobet sig op (Fig. 2B). Sammenfaldende med udseendet af neuroectodermal celler og neuronal differentiering, vil den neuronale specifikke transkriptionel faktor Nurr1, impliceret i dopaminerge neuronal differentiering og aktivering af tyrosin hydroxylase (TH) genet 16, translocate til kernen (Fig. 2B). Efter fritliggende vil RA-behandlede hESCs form, flydende cellulære klynger (neuroblasts) i en suspension kultURE til at fortsætte den neurale differentiering processen. Ved fjernelse af bFGF og efter gør det muligt for neuroblasts at knytte til en vævskultur plade eller seedede i en laminin / kollagen polymeriseret 3-dimensionel matrix i et serum-fri defineret medium, β-III-tubulin-og kort-2-udtrykke, neurite -bærende celler og pigmenterede celler vil begynde at dukke op med en drastisk stigning i effektiviteten i forhold til spontan multi-slægt differentiering af hESCs uden behandling i samme periode, og kunne opretholdes i over 3 måneder (Fig. 2C). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> Figur 1 En skematisk af velkontrollerede effektiv induktion af menneskelige pluripotente stamceller udelukkende til en bestemt klinisk relevante slægtslinje ved simpel bestemmelse af små molekyler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> Figur 2 <strong&gt; Retinsyre inducerer neurale slægt specifikation og neuronal progression direkte af pluripotency under definerede betingelser. (A) Skematisk skildrer af protokollen tidslinje for dirigerede neuronal differentiering af hESCs. (B) Ved eksponering af udifferentierede hESCs til retinsyre (RA) under den definerede kultur-systemet, store differentierede oktober-4 (rød) negative celler i kolonien begyndte at dukke op, i forhold til mock-behandlede (DMSO) hESCs som kontrol . RA-induceret differentierede oktober-4-negative celler begyndte at udtrykke HNK-1 (rød), AP2 (rød), TrkC (grøn), og derefter β-III-tubulin (rød), i overensstemmelse med tidlig neuroectodermal differentiering. Disse celler fortsatte med at modne i sidste ende udtryk for neuronal markør Kort-2 (grøn), som regel i områder, hvor cellerne begyndte at hobe sig op. Sammenfaldende med udseendet af neuroectodermal celler og neuronal differentiering, den neuronale specifikke transkriptionel faktor Nurr1 (grøn), impliceret idopaminerge neuronal differentiering og aktivering af tyrosin hydroxylase (TH) genet, omplantes til kernen. Alle celler er vist ved DAPI farvning af deres kerner (blå). (C) RA behandling inducerer differentiering i retning af en neuronal afstamning med høj effektivitet som vurderet af omfattende netværk af neurite-bærende celler, der udtrykker β-III-tubulin (rød) og Kort-2 (grøn, vist i en 3-dimensionelle matrix). Pilene indikerer pigmenterede celler typisk for dem i CNS. Alle celler er vist ved DAPI farvning af deres kerner (blå) i mellemværker. Skala stænger: 0,1 mm.

<ol>
	<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+improvement+in+a+primate+Parkinson's+model+is+associated+with+multiple+homeostatic+effects+of+human+neural+stem+cells.">Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).</li><li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells.">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nature Rev. 7, 395-406 (2006).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Br&#252;stle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage.">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain. Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., S&#252;dhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Forfatterne erklærer konkurrerende interesser. XHP er grundlægger af Xcelthera. XHP og Eys har intellektuelle egenskaber relateret til hESCs.

En af de store udfordringer for både udviklings-studier og klinisk oversættelsen har været, hvordan at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente menneskelige stamceller til en ønsket fænotype effektivt og forudsigeligt. Selv om sådanne celler kan differentiere spontant in vitro i celler af alle kim lag ved at gå gennem et multi-afstamning samlede fase, kun en lille brøkdel af celler forfølger en bestemt slægt 1,4. I disse hESC-afledte aggregater, ofte samtidige fremkomst af en betydelig mængde af vidt forskellige uønskede celletyper, der kan opholde sig i tre embryonale kim lag gør fremkomsten af ​​ønskede fænotyper ikke bare ineffektivt, men ukontrollable og upålidelige så godt. Selvom hjerte-og neurale slægter nedstammer i tidligere rapporter, men den manglende effektivitet i at generere specialiserede celler ved hjælp af kim-lag-induktion af pluripotente celler og den store risiko for tumorgenicitet følgende transplantation har forhindret yderligere kliniske oversættelse. Den hESC linjer oprindeligt blev udledt og vedligeholdes i samarbejde kultur med vækst-anholdt muse embryonale fibroblaster (MEFs) 4. Selv om flere menneskelige feeder, feeder-fri, og kemisk formuleret kultur systemer er blevet udviklet til hESCs 11-13, de elementer nødvendige og tilstrækkelige for at opretholde selv-fornyelse af menneskelige pluripotente celler forbliver uløste. Disse eksogene feeder celler og biologiske reagenser hjælpe med at opretholde den langsigtede stabil vækst af udifferentierede hESCs mens maske evne til pluripotente celler til at reagere på udviklingsmæssige signaler. Fastholdelse af udifferentierede hESCs i en defineret Biologics-fri kultur system, der tillader trofaste ekspansion og kontrollerbar direkte differentiering er en af ​​nøglerne til deres terapeutiske nytteværdi og potentiale. RA var ikke tilstrækkelig til at fremkalde neuronal differentiering af udifferentierede hESCs vedligeholdt under tidligere rapporteret conditionioner indeholder eksogene feeder celler. Selvom neurale lineages vises på et relativt tidligt tidspunkt i hESC differentiering, behandling hESC-opdelte multi-slægt aggregater (embryoid organer) med RA kun lidt øget lavt udbytte af neuroner 1, 14, 15. For at opnå ensartet konvertering af menneskelige pluripotente stamceller til en bestemt slægt, har vi ansat en defineret kultur system, der kan forsikre spredning af udifferentierede hESCs at identificere vilkårene for velkontrolleret effektiv induktion af pluripotente hESCs udelukkende til en bestemt klinisk relevant afstamning ved simpel bestemmelse af små molekyler (Fig. 1, Fig. 2). Fremtidige undersøgelser vil afsløre genetiske og epigenetiske kontrol molekyler i menneskets CNS udvikling som alternativer, der kan bane vejen for småmolekyle-medieret direkte kontrol og modulering af hESC pluripotente skæbne, når der følger klinisk relevant slægter for regenerativ terapi. Uden RA behandling, 1-5% HESCs vil gennemgå en spontan differentiering i neuronerne 1, 14, 15. Med RA behandling, har vi været i stand til at generere&gt; 95% embryonale neuronal progenitorer og neuroner fra hESCs vedligeholdes under en definerer kultur i en proces, der kan efterligne menneskelige embryonale udvikling 14. For nylig har kendt neurale-skæbne afgørende gener blevet brugt til at transdifferentiate muse fibroblaster til voksne neurale stamceller og neuroner med en lav effektivitet på mellem 0,5-8% 17, 18. Imidlertid har omprogrammeret somatiske celler historisk set været forbundet med unormal genekspression og accelereret ældning med nedsat terapeutisk værktøj 19-21. Endelig er den protokol, vi etableret her begrænset til pluripotente hESCs stammer fra den indre cellemasse (ICM) eller epiblast den menneskelige blastocyst 4, kan ikke gælde for andre pluripotente celler, herunder animalsk oprindelse økonomiske og sociale råd, økonomiske og sociale råd stammer fra tidligere morula (otte -celle)-fase embryoner 22, og artificially omprogrammeret celler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Navn på reagenset </th><th> Firma </th><th> Katalog nummer </th><th> Kommentarer (valgfri) </th></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Vækstfaktor reduceret </td></tr><tr><td> Menneskelige laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> all-trans-Retinsyre </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum udskiftning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM uvæsentlige aminosyre opløsning (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM enMino syrer opløsning (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbinsyre </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF-450 til 02 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-1 til 200 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige NT-3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td&gt; <td> Sigma </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 tillæg (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6-godt ultralow vedhæftet fil plade </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-brønds plade </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Der er et stort udækket behov for et klinisk-egnet menneskelige neuronale celle kilde til reparation eller fornyelse af den beskadigede centrale nervesystem (CNS) struktur og kredsløb i dagens sundhedsvæsen industri. Cellebaserede behandlingsformer ser særdeles lovende ud for at genoprette den tabte nervevæv og funktion for CNS-sygdomme. Imidlertid har celleterapier baseret på CNS-afledte neurale stamceller stødt levere begrænsninger og problemer med at bruge i det kliniske miljø på grund af deres begrænsede ekspansion evne i kultur og svigtende plasticitet efter omfattende passaging 1-3. På trods af nogle gavnlige resultater, synes de CNS-afledte humane neurale stamceller (hNSCs) til at udøve deres terapeutiske virkninger først og fremmest ved deres ikke-neuronale afkom gennem at fremstille trofiske og neuroprotektive molekyler til at redde den endogene cellerne 1-3. Alternativt, pluripotente stamceller fra menneskelige embryoner (hESCs) proffer helbredelsesmetoder for en bred vifte af neurologiske lidelser ved supplying mangfoldigheden af menneskelige neuronale celletyper i udviklingslandene CNS for regenerering 1,4-7. Men hvordan har at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente hESCs effektivt og forudsigeligt til en ønsket fænotype været en stor udfordring for både udviklings-studier og kliniske oversættelse. Konventionelle metoder stole på multi-slægt hældning af pluripotente celler gennem spontane kimlag differentiering, hvilket resulterer i en ineffektiv og ukontrollabel slægt-engagement, der ofte efterfølges af fænotypiske heterogenitet og ustabilitet dermed en høj risiko for tumorgenicitet 7-10. Herudover kan udefinerede udenlandske / dyre biologiske kosttilskud og / eller foderautomater, der har typisk været anvendt til isolering, ekspansion, og differentiering af hESCs gør direkte brug af en sådan celle-specialiserede grafts hos patienter problematisk 11-13. For at overvinde disse forhindringer har vi løst de elementer af en defineret kultur, der er nødvendige og tilstrækkelige for at sustaining den epiblast pluripotence af hESCs, der tjener som en platform for de novo afledningen af klinisk-egnede hESCs og effektivt lede sådanne hESCs ensartet retning af klinisk relevante slægter af små molekyler 14 (se en skematisk i Fig. 1). Retinsyre (RA) inducerer ikke neuronal differentiering af udifferentierede hESCs vedligeholdes på foderautomater 1, 14. Og i modsætning til mus økonomiske og sociale råd, behandling hESC-opdelte embryoid organer (EBS) kun lidt øger lavt udbytte af neuroner 1, 14, 15. Men efter screening en bred vifte af små molekyler og vækstfaktorer, fandt vi, at disse definerede betingelser gengives retinsyre (RA) er tilstrækkelig til at inducere specifikation af neuroectoderm direkte fra pluripotente hESCs at yderligere udviklet sig til neuroblasts, der har genereret menneskelige neurale stamceller og neuroner i udvikling af CNS med høj effektivitet (fig. 2). Vi definerede betingelser for induktion af neuroblaster direkte fra pluripotente hESCs uden mellemliggende multi-slægt embryoid krop scenen, så velkontrolleret effektiv afledning af et stort udbud af menneskelige neuronale celler i hele spektret af udviklingsstadier for celle-baseret terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Vi har etableret en protokol til induktion af neuroblasts direkte fra pluripotente menneskelige embryonale stamceller opretholdes under definerede betingelser med små molekyler, som giver udledning af et stort udbud af menneskelige neurale stamceller og neuronale celletyper i udviklingslandene CNS for neurale reparation.

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen af ​​Telencephalic glutamaterge neuroner fra humane pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af neurale Crest stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret Dopaminerg Neuron Differentiering fra menneskelige pluripotente stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Udledning af leptomeninges eksplantatkulturer fra Postmortem menneskehjerne donorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simpel Generation af højtydende kultur af inducerede neuroner fra menneskelige voksen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omdannelse af humane induceret pluripotente stamceller (iPSCs) til funktionel spinal og kraniel motor neuroner brug PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur af neuroner isoleret fra embryonale mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...