Name: efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

XHP כבר נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקי המכון הלאומי להזדקנות (NIHK01AG024496) ו יוניס קנדי ​​שרייבר המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NIHR21HD056530).

1. הפתרון ומדיה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי פתרון לטין: 0.1% (w / v) ג&#39;לטין DDH 2 O, autoclaved ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Matrigel ציפוי פתרונות. פתרון במלאי: להפשיר Matrigel איטי (10 מ&quot;ל) ב 4 ° C למשך הלילה, להוסיף 10 מ&quot;ל קר כקרח DMEM או DMEM/F12, מערבבים היטב aliquot 1 מ&quot;ל / צינור מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה, חנות ב -20 ° C. פתרון עבודה: הפשרה איטית 1 מ&quot;ל aliquot Matrigel על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2, שעה להעביר 14 מ&quot;ל צונן DMEM או DMEM/F12 ומערבבים היטב מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה מיד לפני הציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון האדם ציפוי laminin: למהול 1 מ&quot;ל האנושי פתרון laminin (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בופר טריס NaCl, לאחסן ב -80 ° C, הפשרה איטית על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1-2) עם קרים כקרח DMEM או DMEM/F12 ל 12.5 מ&quot;ל פתרון עובד (40 מיקרוגרם / מ&quot;ל) מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה מיד לפני הציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורם צמיחה מניות פתרונות (500 1000x): להמיס גורם גדילה ב 10 מיקרוגרם/ Ml במאגר מעוקרות (0.5% BSA, 1.0 מ&quot;מ DTT, גליצרול 10%, 1XPBS) ולאחסן כמו 50-100 μl / צינור aliquots ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> All-טרנס retinoic חומצה עובדים פתרון (1000x): 10 מ&quot;מ DMSO, חנות aliquots ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HESC התקשורת: DMEM/F12 או KO-DMEM (80%), ק.א. החלפת בסרום (20%), L-alanyl-L-L-gln או gln (2 מ&quot;מ), חומצות אמינו חיוניות ממ (MNAA, 1X), ו β-Mercaptoethanol (100 מיקרומטר), מסונן ולאחסן ב 4 ° C, בתוספת bFGF 20 ng / ml לפני השימוש. או החלפה &quot;לדפוק את (KO) תחליף בסרום&quot; עם רכיבים מוגדרים: DMEM/F12 או KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-L-gln או gln (2 מ&quot;מ), MNAA (1X), ממ חיוני חומצות אמינו (MEAA, 1X), ו-β Mercaptoethanol (100 מיקרומטר), מסונן ולאחסן ב 4 ° C, בתוספת bFGF (20 ng / ml), אינסולין אנושי (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), חומצה אסקורבית (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אדם activin (50 ng / ml), Albumax אלבומין / אדם (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), האדם transferrin (8 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NSC התקשורת: DMEM/F12 (100%), N-2 supplemeNT (1X), הפרין (8 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li></ol> 2. ציפוי פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחות עם ג&#39;לטין: להוסיף 2.5 מ&quot;ל / היטב פתרון ג&#39;לטין על 6 צלחות היטב דגירה לילה 37 ° C חממה humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות עם סמל laminin: צמרמורת ג&#39;לטין מצופה צלחות להסיר ג&#39;לטין, להוסיף 2.5 מ&quot;ל / Matrigel טוב או אדם ציפוי laminin פתרון עובד מראש צונן gelatinized 6-גם צלחות דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 3. Passaging וזריעה hESCs מובחן תחת תנאים מוגדרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מושבות hESC לגדול ל 5-7 ימים ישנים, לקחת צלחת תרבות hESC מיקרוסקופ כדי לנתח (טרום חמים לנתח הבמה 37 ° C) מתחת למכסה המנוע לנתח מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבות hESC להיות מפוצל. מורפולוגית, מושבות אלה צריך&gt; hESCs מובחן 75% (תאים קומפקטי קטן), בדרך כלל אטום מעט (לא לבן שנערמו תאים, לא ברור הבדיל תאים) עם יתרון בלתי מוגדרderneath מיקרוסקופ לנתח. בזהירות מתאר המושבות נבחרים להסיר שכבת פיברובלסטים הבדיל המקיפים את המושבה ואת כל חלקי הבדיל (אם בכלל) של המושבה עם הקצה של קצה P2 פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית. (שים לב, hESCs pluripotent הן בשלב חולף, עוברים התמיינות ספונטנית אפילו בתנאים אופטימליים, על אף המועדפת, קשה תאים תזות לברר הם 100% מובחן תחת מיקרוסקופ לנתח,&gt; 75% מובחן נחשבים בדרך כלל כנקודת מעבר. תאים מובחנים בדרך כלל לא הזרע ממשיכים לגדול, בוטלו בתהליך passaging) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה הישנה צף המכיל תאים מובחנים מנותקת על ידי aspirating. לשטוף עם התקשורת hESC (ללא bFGF) פעם אחת. הוסף 3 מ&quot;ל / מדיה hESC טרי היטב המכיל 20 ng / ml bFGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את מושבות hESC מובחן לחתיכות קטנות, ולנתק עם קצה פיפטה סטרילית או זכוכית משך נימי.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התקשורת המכיל חתיכות המושבה מנותקת יחד צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם מ&quot;ל 1 / מדיה hESC היטב המכיל 20 ng / ml bFGF ובריכת יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב Matrigel או פתרון laminin אדם מהצלחות טרי מצופה. 4 Aliquot מ&quot;ל / טוב hESC מדיה המכילה חתיכות המושבה לצלחת 6 באר. להעביר בעדינות את הצלחת באינקובטור ללא רועד לאפשר חתיכות זרע המושבה לילה ללא מפריע ב humidified 37 ° C חממה עם אווירה של 5% CO 2. </li></ol> 4. אינדוקציה עצבית של hESCs תחת מערכת התרבות מוגדר עם החומצה הרטינואית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו יום 3 לאחר זריעה, להסיר את רוב התקשורת הישנה מבאר כל הצלחת ולהשאיר התקשורת מספיק כדי לאפשר מושבות hESC להיות מתחת למים (לא לאפשר hESCs להתייבש). החלף עם 4 מ&quot;ל / מדיה hESC טרי היטב המכיל 20 ng / ml bFGF ו -10 מיקרומטר החומצה הרטינואית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף המדיה הישנה עם המדיה hESC טרי המכיל 20 ng / ml ו bFGFהחומצה הרטינואית 10 מיקרומטר בכל יום אחר, ולאפשר עצבית הנגרמת מושבות hESC לגדול עד היום 7 או 8. כל התאים בתוך המושבה יעברו שינויים במורפולוגיה התמיינות לתאים גדולים ימשיכו להתרבות. מושבות תגדיל את גודל לכסות את הצלחת ביום 7 או 8, ותאי יתחילו להצטבר באזורים מסוימים של המושבות. </li></ol> 5. התמיינות נוירונים המשך בתרבות השעיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תרבות hESC הצלחת לנתח מיקרוסקופ (טרום חמים לנתח הבמה 37 ° C) מתחת למכסה המנוע לנתח מעוקרים. בזהירות מתאר במושבות להסיר שכבת פיברובלסטים המקיפים את המושבה (תאים מובחנים היגרו אל מחוץ למושבה) עם הקצה של קצה P2 פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה הישנה צף המכיל תאים פיברובלסטים מנותקת על ידי aspirating. לשטוף עם התקשורת hESC (ללא bFGF) פעם אחת. הוסף 3 מ&quot;ל / מדיה hESC טרי היטב (ללא bFGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עצבי-iמושבות hESC nduced לחתיכות קטנות, ולנתק עם קצה פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התקשורת המכיל חתיכות המושבה מנותקת יחד צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם מ&quot;ל 1 / מדיה hESC היטב (ללא bFGF) ובריכת יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 4 מ&quot;ל / גם בסרום ללא מדיה hESC המכיל חתיכות המושבה אל צלחת 6-היטב ultralow התקשרות דגירה של 37 ° C חממה humidified כדי לאפשר אשכולות הסלולר צף (neuroblasts) כדי ליצור עבור 4-5 ימים. </li></ol> 6. הפנוטיפ ההבשלה העצבית תרבות דבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת התקשורת המכיל neuroblasts צף יחד צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה בסל&quot;ד 1400 במשך 5 דקות. לשאוב את המדיה הישנה כמו שאתה יכול להוסיף כמות זהה של טרי NSC מדיה המכילה VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), ו - BDNF (10 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב neuroblasts צף aliquot 4 מ&quot;ל / 6 היטב גם הצלחות. Neuroblasts ניתן גם seeded ב laminin / קולגן (Matrigel) או אדם laminin polymerized 3 מימדי המטריצה ​​בסרום ללא מדיה NSC המכיל VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), ו - BDNF (10 ng / ml) . מעבירים את הצלחות ל 37 ° C חממה humidified לאפשר neuroblasts לצרף לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף NSC מדיה המכילה VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), ו - BDNF (10 ng / ml) בכל יום אחר. רשתות נרחב neurite נושאות תאים עצביים ותאי פיגמנט יתחילו להופיע בתוך 2 שבועות של גידול מתמשך ועלייה מספרים עם הזמן, יכול להתקיים במשך 3 חודשים. </li></ol> 7. נציג תוצאות: חומצה רטינואית (RA) מוצג מספיק כדי לגרום hESCs נשמר במערכת התרבות מוגדר המעבר pluripotency בלעדי פנוטיפ neuroectodermal (איור 2A). בחשיפה של hESCs מובחן אל RA, כל התאים בתוך המושבה יעברו שינויים במורפולוגיה כדיתאים מובחנים גדול הפסקת להביע pluripotency הקשורים סמנים, כפי שעולה אוקטובר-4, ולהתחיל לבטא neuroectoderm שונים הקשורים סמנים, כגון HNK1, AP2, ו TrkC (איור 2 ב). תאים אלו מובחנים גדולים ימשיכו להתרבות המושבות יגדל בגודל, הליך ספונטני להביע את הסמן העצבית מוקדם β-III-טובולין (איור 2 ב). סמן נוירונים בוגרים יותר מפה-2 יתחיל להופיע באזורים של מושבות תאים שבהם יש נערמו (איור 2 ב). ביחד עם הופעתו של התאים neuroectodermal והבחנה עצבי, הגורם העצבית תעתיק ספציפי Nurr1, מעורב התמיינות נוירונים דופאמינרגיים ההפעלה של hydroxylase טירוזין (TH) גן 16, יהיה translocate לגרעין (איור 2 ב). לאחר מנותקת, hESCs RA שטופלו יהוו אשכולות הסלולר צף (neuroblasts) בפולחן השעיהיור להמשיך בתהליך התמיינות עצביים. לאחר הסרת bFGF ואחרי המתיר neuroblasts לצרף צלחת רקמה תרבות או זרע polymerized laminin / קולגן 3 מימדי המטריצה ​​במדיום בסרום ללא מוגדר, β-III-טובולין, ומפת-2-להביע, neurite נושאות תאים תאים פיגמנט יתחילו להופיע עם עלייה דרסטית יעילות לעומת בידול רב השושלת ספונטנית של hESCs ללא טיפול במשך אותה תקופה, יכול להתקיים במשך 3 חודשים (איור 2C). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> איור 1 סכימטי של אינדוקציה מבוקר היטב יעיל בתאי גזע אנושיים pluripotent בלעדי שושלת קליני רלוונטי במיוחד על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> איור 2 <stroחומצה ng&gt; retinoic גורם מפרט השושלת עצביים התקדמות עצבי ישיר pluripotency בתנאים מוגדרים. (א) סכמטי המתאר של הקו פרוטוקול זמן של בידול מכוון של נוירונים hESCs. (ב) עם חשיפה של hESCs מובחן לחומצה רטינואית (RA) תחת מערכת התרבות מוגדר, גדול הבדיל אוקטובר-4 (אדום) בתאי שלילי בתוך המושבה החלו להופיע, לעומת מדומה שטופלו (DMSO) hESCs כמו שליטה . RA-Induced תאים אוקטובר-4-השלילית הבדיל החלו להביע HNK-1 (אדום), AP2 (אדום), TrkC (ירוק), ולאחר מכן β-III-טובולין (אדום), עולה בקנה אחד עם בידול neuroectodermal מוקדם. תאים אלה המשיכה בשלה בסופו של דבר לבטא את הסמן העצבית מפת-2 (ירוק), בדרך כלל באזורים שבהם התאים החלו להיערם. ביחד עם הופעתו של התאים neuroectodermal והבחנה עצבית, את עצבי ספציפי גורם Nurr1 תעתיק (ירוק), מעורבבידול עצבי דופאמין והפעלה של hydroxylase הגן טירוזין (TH), translocated לגרעין. כל התאים מוצגים על ידי מכתים DAPI הגרעינים שלהם (כחול). (ג) לטיפול בדלקת מפרקים שגרונית גורם בידול כלפי שושלת העצבית עם יעילות גבוהה כפי שהוערכו על ידי רשתות נרחב של neurite נושאות תאים להביע β-III-טובולין (אדום) ומפת-2 (ירוק, המוצג מטריקס 3-dimentional א). החצים מצביעים על תאים פיגמנט טיפוסית של אלה במערכת העצבים המרכזית. כל התאים מוצגים על ידי מכתים DAPI הגרעינים שלהם (כחול) ריבועי. סולם ברים: 0.1 מ&quot;מ.

<ol>
	<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+improvement+in+a+primate+Parkinson's+model+is+associated+with+multiple+homeostatic+effects+of+human+neural+stem+cells.">Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).</li><li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells.">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nature Rev. 7, 395-406 (2006).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Br&#252;stle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage.">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain. Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., S&#252;dhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים אינטרסים מתחרים. XHP הוא המייסד של Xcelthera. XHP ו EYS יש קניין רוחני הקשור hESCs.

אחד האתגרים הגדולים עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליני כבר איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של pluripotent בתאי גזע אנושיים הפנוטיפ הרצוי ביעילות כצפוי. למרות תאים כאלה יכולים להבדיל באופן ספונטני במבחנה לתאים של כל שכבות הנבט ידי עובר שלב רב שושלת צבירה, רק חלק קטן של תאים להמשיך 1,4 השושלת נתון. באותם hESC הנגזרות אגרגטים, המראה בו זמנית של כמות ניכרת של מסתעף נרחב סוגי תאים לא רצויים אשר עשויים להימצא בתוך שלוש שכבות נבט עובריים לעתים קרובות הופך את הופעתה של פנוטיפים הרצוי לא רק לא יעילה, אבל בלתי נשלט ולא אמינה גם כן. למרות שושלות לב עצביים כבר נגזר בדוחות הקודמים, עם זאת, יעילות ביצירת תאים מיוחדים באמצעות אינדוקציה נבט-שכבה של תאים pluripotent לבין סיכון גבוה tumorigenicity הבאים transplantation יש הפריע התרגום קליניים נוספים. הקווים hESC בתחילה נגזרו ומתוחזק בתרבות בשיתוף עם צמיחה נעצר עכבר fibroblasts עובריים (MEFs) 4. למרות מזין אנושי מספר, מזין חופשי, ומערכות תרבות כימי ניסח פותחו עבור 11-13 hESCs, האלמנטים הכרחי ומספיק לקיום העצמי התחדשות של תאים pluripotent אדם נותרו לא פתורות. תאים אלה מזין אקסוגניים ו ריאגנטים ביולוגיים לעזור לשמור על צמיחה ארוכת טווח יציבה של hESCs מובחן ואילו למסכה היכולת של התאים pluripotent להגיב על אותות התפתחותיים. שמירה hESCs מובחן במערכת ביולוגי ללא מוגדר תרבות המאפשר הרחבת נאמן בידול ישיר לשליטה הוא אחד המפתחות השירות הטיפולי שלהם ואת הפוטנציאל. RA לא היה די כדי לגרום בידול העצבית של hESCs מובחן נשמר תחת Condit בעבר דיווחיונים מזין המכיל תאים חיצוניים. למרות שושלות עצביים מופיעים בשלב מוקדם יחסית בידול hESC, טיפול hESC-הבדיל רב השושלת אגרגטים (גופים embryoid) עם RA גדל רק במעט את התשואה הנמוכה של נוירונים 1, 14, 15. על מנת להשיג אחיד ההמרה של אדם בתאי גזע pluripotent לשושלת מסוימת, אנחנו עובדים מערכת תרבות מוגדרת מסוגלים לבטח את הפצת hESCs מובחן לזהות תנאים לזירוז מבוקר היטב יעיל של hESCs pluripotent בלעדי מסוים בשושלת קליני רלוונטי על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות (איור 1, איור. 2). מחקרים עתידיים יגלה מולקולות בקרה גנטית epigenetic בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית האדם חלופות, אשר עשוי לסלול את הדרך לשלוט מולקולה בתיווך קטן אפנון ישיר של גורל pluripotent hESC כאשר הנובעות שושלות קליני רלוונטי עבור טיפולים רגנרטיבית. ללא טיפול בדלקת מפרקים שגרונית, 1-5HESCs% יעברו התמיינות ספונטנית לתוך נוירונים 1, 14, 15. באמצעות טיפול בדלקת מפרקים שגרונית, הצלחנו לייצר&gt; 95% אבות העצבית העוברית נוירונים מ hESCs שמרו תחת תרבות להגדיר בתהליך שעשוי לחקות ההתפתחות העוברית האנושית 14. לאחרונה, ידוע עצביים-בקביעת גורל גנים שימשו transdifferentiate fibroblasts העכבר לתוך אבות עצביים נוירונים בוגרים עם יעילות נמוכה בטווח 0.5-8% 17, 18. עם זאת, reprogrammed התאים הסומטיים יש היסטורית היה קשור ביטוי גנים חריגים הזדקנות מואצת עם התועלת הטיפולית לקויי 19-21. לבסוף, פרוטוקול הקמנו כאן מוגבל hESCs pluripotent נגזר מסת התאים הפנימית (ICM) או epiblast של הבלסטוציסט אדם 4, אינן חלות pluripotent תאים אחרים, כולל בעלי חיים שמקורם ESCs, ESCs נגזר מוקדם יותר morula (שמונה תאים) בשלב עוברי 22, ו artifתאים reprogrammed icially 23.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> לטין </td><td> סיגמא </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> במדעי החיים BD </td><td> 356231 </td><td> גורם צמיחה מופחת </td></tr><tr><td> האדם laminin </td><td> סיגמא </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> כל טרנס retinoic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-החוצה בסרום תחליף </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> ממ פתרון חומצת אמינו חיונית (MNAA, 100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> מממינו פתרון חומצות (MEAA, 100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> האדם transferrin </td><td> סיגמא </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> האדם bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18 ב </td><td></td></tr><tr><td> האדם אינסולין </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> האדם activin </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> האדם BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF-450-02 </td><td></td></tr><tr><td> האדם VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-1-200 </td><td></td></tr><tr><td> האדם NT-3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> הפרין </tד&gt; <td> סיגמא </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 תוספת (100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6 טוב מצורף ultralow צלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם צלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

יש צורך גדול התגשמו מקור תא אנושי קליני מתאים העצבית לתיקון או התחדשות של מערכת נזק העצבים המרכזית (CNS) מבנה המעגלים בתעשיית הבריאות של היום. Cell טיפולים מבוססי לקיים הבטחה גדולה כדי להחזיר את תפקוד רקמת עצב אבוד בהפרעות מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, טיפולים המבוססים על תאים CNS-derived בתאי גזע עצביים נתקלים הגבלת היצע קושי להשתמש בסביבה קלינית בשל היכולת הרחבה מוגבלת שלהם בתרבות פלסטיות נכשל לאחר 1-3 passaging נרחב. למרות כמה תוצאות מועילות, CNS-derived תאים אנושיים גזע עצביים (hNSCs) מופיעים להפעיל השפעות טיפוליות שלהם בעיקר על ידי progenies הלא העצבית שלהם באמצעות trophic בייצור מולקולות neuroprotective להציל את התאים אנדוגני 1-3. לחלופין, pluripotent בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) להציע תרופות למגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות ידי supplying את המגוון של סוגי התאים האנושיים העצבית העצבים המרכזית פיתוח להתחדשות 1,4-7. עם זאת, איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של hESCs pluripotent ביעילות כצפוי על הפנוטיפ הרצוי כבר אתגר גדול עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליניים. הגישות המקובלות להסתמך על הנטייה רב שושלת היוחסין של תאים pluripotent באמצעות בידול נבט ספונטנית שכבה, וכתוצאה מכך מחויבות-השושלת יעיל ובלתי נשלט זה מלווה לעתים קרובות ההטרוגניות יציבות פנוטיפי, ולכן, סיכון גבוה tumorigenicity 7-10. בנוסף, מוגדר תוספי ביולוגיים זרים / חיה ו / או ניזונים, כי יש בדרך כלל נעשה שימוש בבידוד, הרחבה, בידול של hESCs רשאי לעשות שימוש ישיר של תאים מיוחדים כגון שתלים בחולים בעייתי 11-13. כדי להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו צריכים לפתור את האלמנטים של מערכת התרבות מוגדר הכרחי ומספיק sustaining pluripotence epiblast של hESCs, משמש כפלטפורמה הגזירה דה נובו של hESCs קלינית מתאימה ויעילה בימוי hESCs כזה אחיד כלפי שושלות קלינית רלוונטית על ידי מולקולות קטנות 14 (ראה סכמטית באיור. 1). חומצה רטינואית (RA) לא להשרות התמיינות נוירונים של hESCs מובחן שמרו על ניזונים 1, 14. ובניגוד ESCs עכבר, טיפול hESC-הבדיל גופים embryoid (EBS) רק מגביר במקצת את התשואה הנמוכה של נוירונים 1, 14, 15. עם זאת, לאחר הקרנת מגוון רחב של מולקולות קטנות, ובדרך גורמי גדילה, מצאנו כי התנאים שניתנו מוגדרים כגון חומצה רטינואית (RA) מספיק כדי לגרום את המפרט של neuroectoderm ישירה hESCs pluripotent כי עוד התקדם neuroblasts שהפיק אבות העצבית האנושית נוירונים CNS פיתוח עם יעילות גבוהה (איור 2). הגדרנו תנאים אינדוקציה של נוירוישיר hESCs pluripotent ללא שלב להתערב רב השושלת הגוף embryoid, המאפשר מבוקר היטב הגזירה יעיל של היצע גדול של תאים עצביים אדם מכל גווני הקשת של שלבי ההתפתחות של התא מבוסס הרפוי תקיעות.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...