Name: efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

XHP har vært støttet av National Institute of Health (NIH) stipend fra National Institute on Aging (NIHK01AG024496) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

1. Løsning og Media Forberedelse <ol><li> Gelatin belegg løsning: 0,1% (w / v) gelatin i DDH 2 O, autoklaveres og oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Matrigel belegg løsninger. Stamoppløsning: slow tine Matrigel (10 ml) ved 4 ° C over natten, tilsett 10 ml iskald DMEM eller DMEM/F12, bland godt og delmengde 1 ml / rør under sterilisert vev kultur hette, lagring ved -20 ° C. Working løsning: langsom tining 1 ml Matrigel delmengde ved 4 ° C i 1-2 timer, transfer til 14 ml kjølt DMEM eller DMEM/F12 og bland godt under sterilisert vevskultur panseret umiddelbart før belegg. </li><li> Menneskelig laminin belegg løsning: fortynnes 1 ml human laminin oppløsning (0,5 mg / ml i Tris bufret NaCl, oppbevares ved -80 ° C, langsom tining ved 4 ° C i 1-2 time) med iskald DMEM eller DMEM/F12 til 12,5 ml arbeidsløsningen (40 mikrogram / ml) under sterilisert vevskultur panseret umiddelbart før belegg. </li><li> Vekstfaktor stamløsninger (500-1000x): Løs vekstfaktor ved 10 mikrogram/ Ml i steriliseres buffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glyserol, 1XPBS) og lagre så 50-100 mL / tube alikvoter ved -80 ° C. </li><li> All-trans-retinsyre arbeider løsning (1000x): 10 mm i DMSO, butikken i alikvoter ved -80 ° C. </li><li> HESC media: DMEM/F12 eller KO-DMEM (80%), KO serum utskifting (20%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MEM unødvendige aminosyrer (MNAA, 1X), og β-Mercaptoethanol (100 mm), filtrert og oppbevar ved 4 ° C, supplert med 20 ng / ml bFGF før bruk. Eller erstatte &quot;knock out (KO) serum erstatning&quot; med definerte komponenter: DMEM/F12 eller KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essensielle aminosyrer (MEAA, 1X), og β-Mercaptoethanol (100 mm), filtrert og oppbevar ved 4 ° C, supplert med bFGF (20 ng / ml), humant insulin (20 mikrogram / ml), askorbinsyre (50 mikrogram / ml), human activin A (50 ng / ml), humant albumin / Albumax (10 mg / ml) og human transferrin (8 mikrogram / ml) før bruk. </li><li> NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), heparin (8 mikrogram / ml). </li></ol> 2. Plate Coating <ol><li> Coat plater med gelatin: Legg 2,5 ml / brønn av gelatin løsning til 6 godt plater og inkuberes over natten i 37 ° C fuktet inkubator. </li><li> Coat plater med laminin: chill gelatin-belagte plater og fjerne gelatin, tilsett 2,5 ml / brønn Matrigel eller menneskelig laminin belegg arbeider løsning til pre-kjølt gelatinized 6-brønn plater og inkuber ved 4 ° C over natten. </li></ol> 3. Passaging og Seeding Udifferensiert hESCs under definerte vilkår <ol><li> La hESC kolonier vokse til 5-7 dager gamle, og ta hESC kultur plate å dissekere mikroskop (pre-varm dissecting scenen til 37 ° C) under dissecting sterilisert panseret. </li><li> Velg hESC kolonier for å deles. Morfologisk, bør disse koloniene har&gt; 75% udifferensiert hESCs (små kompakte celler), vanligvis litt ugjennomsiktig (ikke hvit-stablet opp celler, ikke klart differensierte celler) med definerte kanten underneath den dissecting mikroskop. Nøye skissere valgt koloniene og fjerne differensiert fibroblast lag som omgir koloni og all differensiert deler (hvis noen) av kolonien med kanten av P2 steril pipette tips eller trukket glass kapillær. (Vær oppmerksom pluripotent hESCs er på et forbigående stadium, gjennomgår spontan differensiering selv under optimale forhold, men foretrukket, er det vanskelig å fastslå teser cellene er 100% udifferensiert henhold dissekere mikroskop,&gt; 75% udifferensiert er vanligvis betraktet som passerer punktet. differensierte celler vanligvis vil ikke frø og fortsette å vokse, eliminert i passaging prosessen) </li><li> Fjern det gamle medier som inneholder flytende frittliggende differensierte celler ved å aspirere. Vask med hESC media (uten bFGF) en gang. Tilsett 3 ml / brønn frisk hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF. </li><li> Kutt udifferensiert hESC koloniene i små biter, og ta med sterile pipettespiss eller trukket glass kapillær.</li><li> Pool at medier som inneholder frittliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk tube. Vask platen en gang med 1 ml / brønn hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF og basseng sammen. </li><li> Aspirer Matrigel eller menneskelig laminin løsning fra belagt ferske plater. Delmengde 4 ml / brønn hESC medier som inneholder koloni stykker til en 6-brønn plate. Forsiktig overføre plate til inkubator uten risting og la koloni stykker frø over natten uten å forstyrre i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO 2. </li></ol> Fire. Neural Induksjon av hESCs under definerte Kultur System med retinsyre <ol><li> På dag 3 etter såing, fjerner det meste av gamle medier fra hver brønn av platen og la nok media til å tillate hESC kolonier å være neddykket (aldri tillate hESCs tørke ut). Erstatt med 4 ml / brønn frisk hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF og 10 mM retinsyre. </li><li> Bytt ut gamle medier med ferske hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF og10 mm retinsyre annenhver dag, og la nevrale-induced hESC kolonier vokse til dag 7 eller 8. Alle cellene i kolonien vil gjennomgå morfologi endringer til store differensierte celler som vil fortsette å formere seg. Koloniene vil øke i størrelse for å dekke platen dag 7 eller 8, og cellene begynner å hope seg opp i enkelte områder av koloniene. </li></ol> 5. Fortsetter neuronal Differensiering i Suspension Kultur <ol><li> Ta hESC kultur plate å dissekere mikroskop (pre-varm dissecting scenen til 37 ° C) under dissecting sterilisert panseret. Nøye skissere koloniene og fjerne fibroblast lag rundt kolonien (differensierte celler vandret ut av kolonien) med kanten av P2 steril pipette tips eller trukket glass kapillær. </li><li> Fjern det gamle medier som inneholder flytende frittliggende fibroblast celler ved å aspirere. Vask med hESC media (uten bFGF) en gang. Tilsett 3 ml / brønn frisk hESC media (uten bFGF). </li><li> Kutt nevrale-induced hESC kolonier i små biter, og ta med sterile pipettespiss eller trukket glass kapillær. </li><li> Pool at medier som inneholder frittliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk tube. Vask platen en gang med 1 ml / brønn hESC media (uten bFGF) og basseng sammen. </li><li> Delmengde 4 ml / brønn serum-free hESC medier som inneholder koloni stykker til en 6-godt ultralav festeplate og inkuberes i en 37 ° C fuktet inkubator å tillate flytende cellulære klynger (neuroblasts) til skjema for 4-5 dager. </li></ol> Seks. Neuronal Phenotype Modning i Adhesive Kultur <ol><li> Pool media inneholder flytende neuroblasts sammen i en 50 ml konisk tube. Sentrifuger ved 1400 rpm i 5 min. Aspirer de gamle mediene så mye du kan og legge like mye frisk NSC medier som inneholder VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) og BDNF (10 ng / ml). </li><li> Pipetter opp og ned for å blande flytende neuroblasts og delmengde 4 ml / godt til 6-brønn plater. Den neuroblasts kan også seeded i laminin / kollagen (Matrigel) eller menneskelig laminin polymerisert 3-dimensjonal matrise i serum-free NSC medier som inneholder VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) og BDNF (10 ng / ml) . Overfør platene til en 37 ° C fuktet inkubator å tillate neuroblasts å feste natten. </li><li> Bytt NSC medier som inneholder VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) og BDNF (10 ng / ml) annenhver dag. Omfattende nettverk av neurite-bærende neuronal celler og pigmenterte celler vil begynne å vises innen 2 uker med kontinuerlig dyrking og økning i antall med tiden, og kunne opprettholdes i over 3 måneder. </li></ol> 7. Representant Resultater: Retinsyre (RA) er gjengitt tilstrekkelig til å indusere hESCs opprettholdt i de definerte kultur-systemet til overgangen fra pluripotency utelukkende til et neuroectodermal fenotype (fig. 2A). Ved eksponering av udifferensiert hESCs til RA, vil alle cellene i kolonien gjennomgå morfologi endringerstore differensierte celler som opphøre uttrykker pluripotency-assosiert markører, som indikert av okt-4, og begynne å uttrykke ulike neuroectoderm-assosiert markører, slik som HNK1, AP2, og TrkC (Fig. 2B). Disse store differensierte cellene vil fortsette å formere seg og koloniene vil øke i størrelse, går spontant å uttrykke tidlig neuronal markør β-III-tubulin (Fig. 2B). Jo mer modne neuronal markør Kart-2 vil begynne å vises i områder av kolonier hvor cellene har stablet opp (Fig. 2B). Sammenfallende med utseendet på neuroectodermal celler og nevrale differensiering, vil neuronal spesifikke transcriptional faktor Nurr1, innblandet i dopaminerge neuronal differensiering og aktivering av tyrosin hydroksylase (TH) genet 16, translocate til kjernen (Fig. 2B). Etter frittliggende, vil RA-behandlede hESCs danne flytende cellulære klynger (neuroblasts) i en suspensjon kulture å fortsette neural differensiering prosessen. Ved fjerning av bFGF og etter tillater neuroblasts å feste til en vev kultur plate eller seedet i en laminin / kollagen polymerisert 3-dimensjonal matrise i et serum-free definert medium, β-III-tubulin-og kart-2-uttrykke, neurite -bærende celler og pigmenterte celler vil begynne å dukke opp med en drastisk økning i effektiviteten i forhold til spontane multi-avstamning differensiering av hESCs uten behandling i løpet av samme tidsperiode, og kunne opprettholdes i over 3 måneder (Fig. 2C). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> Figur 1 En skjematisk godt kontrollerte effektiv induksjon av menneskelige pluripotent stamceller eksklusivt til en bestemt klinisk relevant avstamning med enkle bestemmelse av små molekyler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> Figur 2 <strong&gt; Retinoic syre induserer nevrale avstamning spesifikasjon og neuronal progresjon direkte av pluripotency under definerte vilkår. (A) Skjematisk skildrer av protokollen tid linje rettet nevronal differensiering av hESCs. (B) Ved eksponering av udifferensiert hESCs til retinsyre (RA) under definerte kulturen, stort differensiert Oct-4 (rød) negative cellene i kolonien begynte å dukke opp, sammenlignet med mock-behandlet (DMSO) hESCs som kontroll . RA-indusert differensiert Oct-4-negative cellene begynte å uttrykke HNK-1 (rød), AP2 (rød), TrkC (grønn), og deretter β-III-tubulin (rød), i samsvar med tidlig neuroectodermal differensiering. Disse cellene fortsatte å modne slutt uttrykker neuronal markør Kart-2 (grønn), vanligvis i områder der cellene begynte å hope seg opp. Sammenfallende med utseendet på neuroectodermal celler og nevrale differensiering, det neuronal spesifikke transcriptional faktor Nurr1 (grønn), innblandet idopaminerge neuronal differensiering og aktivering av tyrosin hydroksylase (TH) genet, translocated til kjernen. Alle celler er vist ved DAPI farging av atomkjerner deres (blå). (C) RA behandling induserer differensiering mot en neuronal avstamning med høy effektivitet som vurderes av omfattende nettverk av neurite-bærende celler uttrykker β-III-tubulin (rød) og kart-2 (grønn, vist i en 3-dimensjonale matrise). Pilene viser pigmenterte celler typisk for de i CNS. Alle celler er vist ved DAPI farging av atomkjerner deres (blå) i innfellinger. Scale barer: 0,1 mm.

<ol>
	<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+improvement+in+a+primate+Parkinson's+model+is+associated+with+multiple+homeostatic+effects+of+human+neural+stem+cells.">Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).</li><li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells.">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nature Rev. 7, 395-406 (2006).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Br&#252;stle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage.">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain. Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., S&#252;dhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Forfatterne erklærer konkurrerende interesser. XHP er grunnleggeren av Xcelthera. XHP og eys har intellektuelle egenskaper relatert til hESCs.

En av de store utfordringene for både utviklings-studier og klinisk oversettelsen har vært hvordan å kanalisere den brede differensiering potensial pluripotent menneskelige stamceller til en ønsket fenotype effektivt og forutsigbart. Selv om slike celler kan differensiere spontant in vitro inn i cellene til alle bakterie lagene ved å gå gjennom en multi-avstamning samlet scenen, bare en liten brøkdel av celler forfølge et gitt avstamning 1,4. I disse hESC-avledet aggregater, gjør samtidig utseendet til en betydelig mengde vidt forskjellige uønskede celletyper som kan ligge i tre embryonale bakterie lag ofte fremveksten av ønsket fenotyper ikke bare ineffektivt, men ukontrollerbar og upålitelige også. Selv om hjerte-og nevrale linjene har blitt utledet i tidligere rapporter, men ineffektiviteten i generere spesialiserte celler gjennom bakterie-lags-induksjon av pluripotent celler og den høye risikoen for tumorigenicity følgende transplantation har hindret ytterligere klinisk oversettelse. Den hESC linjene i utgangspunktet var avledet og vedlikeholdes i samarbeid kultur med vekst-arrestert mus embryonale fibroblaster (MEFs) 4. Selv om flere mennesker mater, mater-fri, og kjemisk formulert kulturen systemer har blitt utviklet for 11-13 hESCs, elementene nødvendig og tilstrekkelig for å opprettholde den selvfornyelse av menneskelige pluripotent celler forblir uløste. Disse eksogene mater celler og biologiske reagenser bidra til å opprettholde en langsiktig stabil vekst av udifferensiert hESCs mens maske evne pluripotent celler til å svare på utviklingsmessige signaler. Opprettholde udifferensiert hESCs i en definert biologiske-free kultur system som lar trofaste ekspansjon og kontrollerbart direkte differensiering er en av nøklene til deres terapeutiske nytte og potensial. RA var ikke tilstrekkelig til å indusere nevronal differensiering av udifferensiert hESCs vedlikeholdt under tidligere rapportert Conditioner inneholder eksogene mater celler. Selv om nevrale linjene vises på et relativt tidlig stadium i hESC differensiering, behandle hESC-differensiert multi-avstamning aggregater (embryoid organer) med RA kun noe økt den lave avkastningen av en nevroner, 14, 15. For å oppnå jevnt konvertering av menneskelige pluripotent stamceller til en bestemt avstamning, benyttet vi en definert kultur system i stand til å opprettholde spredning av udifferensiert hESCs å identifisere betingelsene for godt kontrollerte effektiv induksjon av pluripotent hESCs utelukkende til en bestemt klinisk relevant avstamning ved enkle bestemmelse av små molekyler (fig. 1, fig. 2). Fremtidige studier vil avdekke genetiske og epigenetic kontroll molekyler i menneskets CNS utvikling som alternativer, som kan bane vei for lite molekyl-mediert direkte kontroll og modulering av hESC pluripotent skjebne når utlede klinisk relevante linjene for regenerativ behandling. Uten RA behandling, 1-5% HESCs vil gjennomgå spontan differensiering inn i en nevroner, 14, 15. Med RA behandling, har vi vært i stand til å generere&gt; 95% embryonale nevrale stamceller og nevroner fra hESCs opprettholdes under en definerer kultur i en prosess som kan etterligne humane embryonale utvikling 14. Nylig har kjent nevrale-skjebnen bestemme gener blitt brukt til å transdifferentiate musen fibroblaster i voksen nevrale stamceller og nevroner med lav virkningsgrad som spenner 0,5 til 8% 17, 18. Imidlertid har reprogrammeres somatiske celler historisk sett vært forbundet med unormal genekspresjon og akselerert senescence med nedsatt terapeutisk nytte 19-21. Endelig er protokollen vi har etablert her begrenset til pluripotent hESCs avledet fra den indre cellemasse (ICM) eller epiblast av den menneskelige blastocyst 4, kan ikke gjelde for andre pluripotent celler, inkludert dyre-stammer ESCs, ESCs avledet fra tidligere morula (åtte -celle)-trinns embryo 22, og artificially omprogrammeres celler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Navn på reagens </th><th> Firma </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (valgfritt) </th></tr><tr><td> Gelatin </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD biovitenskap </td><td> 356231 </td><td> Vekstfaktor redusert </td></tr><tr><td> Menneskelig laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> all-trans-Retinoic syre </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum erstatning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM uviktig aminosyre løsning (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM enMino syrer løsning (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsyre </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF-450-02 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-20 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig NT-3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td&gt; <td> Sigma </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 supplement (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6-godt ultralav festeplate </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-bra plate </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Det er et stort uoppfylte behov for en klinisk egnet human neuronal cell kilde for reparasjon eller regenerering av den skadede sentralnervesystemet (CNS) struktur og kretser i dagens helsevesenet. Cell-baserte terapier holde store løftet for å gjenopprette den tapte nervevev og funksjon for CNS lidelser. Imidlertid har cellen terapi basert på CNS-avledet nevrale stamceller oppstått supply begrensning og vanskeligheter med å bruke i klinisk setting på grunn av deres begrensede ekspansjon evne i kultur og sviktende plastisitet etter omfattende passaging 1-3. Til tross for noen gunstig utfall, CNS-avledet humane nevrale stamceller (hNSCs) ser ut til å utøve sin terapeutiske effekter primært av sine ikke-nevronale progenies gjennom produsere trofiske og nervecellene molekyler for å redde den endogene cellene 1-3. Alternativt pluripotent humane embryonale stamceller (hESCs) proffer botemidler for et bredt spekter av nevrologiske lidelser ved supplying mangfoldet av menneskelige neuronal celletyper i utviklingsland CNS for regenerering 1,4-7. Har imidlertid hvordan å kanalisere den brede differensiering potensial pluripotent hESCs effektivt og forutsigbart til en ønsket fenotype vært en stor utfordring for både utviklings-studier og klinisk oversettelse. Konvensjonelle tilnærminger stole på multi-avstamning helning pluripotent celler gjennom spontan germ lag differensiering, noe som resulterer i ineffektive og ukontrollerbar avstamning-engasjement som ofte følges av fenotypiske heterogenitet og ustabilitet, dermed høy risiko for tumorigenicity 7-10. I tillegg kan udefinert utenlandske / dyr biologisk kosttilskudd og / eller feeders som har typisk vært brukt til isolasjon, ekspansjon, og differensiering av hESCs gjør direkte bruk av slike celle-spesialiserte grafts hos pasienter problematisk 11-13. For å overvinne disse hindringene, har vi løst elementene i en definert kultur system nødvendig og tilstrekkelig for sustaining den epiblast pluripotence av hESCs, tjene som en plattform for de novo avledning av klinisk egnet hESCs og effektivt lede slike hESCs jevnt mot klinisk relevant overleveringslinjer av små molekyler 14 (se en skjematisk i fig. 1). Retinsyre (RA) induserer ikke nevronal differensiering av udifferensiert hESCs vedlikeholdes på feeders 1, 14. Og i motsetning til mus ESCs, behandle hESC-differensiert embryoid organer (EBS) bare litt øker den lave avkastningen av en nevroner, 14, 15. Men etter screening et utvalg av små molekyler og vekstfaktorer, fant vi at slike definerte vilkår gjengitt retinsyre (RA) er tilstrekkelig til å indusere angivelse av neuroectoderm direkte fra pluripotent hESCs at videre kommet til neuroblasts som genererte menneskelige nevrale stamceller og nevroner i utvikle CNS med høy effektivitet (fig 2). Vi definerte vilkår for induksjon av nevroEksplosjonene direkte fra pluripotent hESCs uten en mellomliggende multi-avstamning embryoid kroppen stadium, slik at godt kontrollerte effektiv avledning av en stor tilførsel av menneskelig neuronal celler over hele spekteret av utviklingsstadier for celle-basert terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Vi har etablert en protokoll for induksjon av neuroblasts direkte fra pluripotent humane embryonale stamceller vedlikeholdt under definerte forhold med små molekyler, som muliggjør avledning av en stor tilførsel av menneskelig neuronal stamfedre og neuronal celletyper i utviklingsland CNS for nevrale reparasjon.

Effektiv Utledning av Human nevrale stamceller og nevroner fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-free Utledning av Neural Crest stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regissert dopaminerge Neuron Differensiering fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Avledning av leptomeninges eksplantering kulturer fra postmortem menneskelige hjerne givere

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkel generasjon av en høy avkastning kultur indusert neurons fra menneskelige voksne huden fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Konvertering av Human indusert pluripotent Stem Cells (iPSCs) i funksjonell spinal og skallen motor neurons bruke PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur neurons isolert fra embryonale mus lillehjernen

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal Differensiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Avledning, utvidelse, kryopreservasjon og karakterisering av mikrovaskulære endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...