Name: efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

XHP har fått stöd av National Institute of Health (NIH) anslag från National Institute on Aging (NIHK01AG024496) och The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development (NIHR21HD056530).

1. Lösning och Media förberedelse <ol><li> Gelatin beläggning lösning: 0,1% (w / v) gelatinfolier DDH 2 O, autoklaveras och förvara vid 4 ° C. </li><li> Matrigel beläggning lösningar. Stamlösning: långsam upptining Matrigel (10 ml) vid 4 ° C över natten, tillsätt 10 ml iskall DMEM eller DMEM/F12, blanda väl och delprov 1 ml / rör under steriliseras vävnadsodling huva, förvara vid -20 ° C. Arbetslösning: långsam upptining 1 ml Matrigel alikvot vid 4 ° C i 1-2 timmar, transfer till 14 ml kyld DMEM eller DMEM/F12 och blanda väl under steriliseras vävnadsodling huva omedelbart före beläggning. </li><li> Mänskliga laminin beläggning lösning: Späd 1 ml humant laminin lösning (0,5 mg / ml i Tris buffrat NaCl, förvara vid -80 ° C, sakta tina i 4 ° C i 1-2 timmar) med iskall DMEM eller DMEM/F12 till 12,5 ml brukslösning (40 mikrogram / ml) under steriliserade vävnadsodling huva omedelbart före beläggning. </li><li> Tillväxtfaktor stamlösningar (500-1000X): lös tillväxtfaktor vid 10 mikrogram/ Ml steriliserade buffert (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycerol, 1XPBS) och lagrar som 50-100 l / rör alikvoter vid -80 ° C. </li><li> All-trans-retinoinsyra brukslösning (1000): 10 mm i DMSO, butik i alikvoter vid -80 ° C. </li><li> HESC media: DMEM/F12 eller KO-DMEM (80%), KO serum ersättning (20%), L-Alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MEM onödiga aminosyror (MNAA, 1X), och β-Mercaptoethanol (100 M), filtreras och lagras vid 4 ° C, kompletterat med 20 ng / ml bFGF före användning. Eller byta ut &quot;knock out (KO) serum byte&quot; med definierade komponenter: DMEM/F12 eller KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM viktigt aminosyror (MEAA, 1X) och β-Mercaptoethanol (100 M), filtreras och lagras vid 4 ° C, kompletterat med bFGF (20 ng / ml), humant insulin (20 mikrogram / ml), askorbinsyra (50 mikrogram / ml), mänskliga Activin A (50 ng / ml), humant albumin / Albumax (10 mg / ml), och mänskliga transferrin (8 mikrogram / ml) före användning. </li><li> NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), heparin (8 mikrogram / ml). </li></ol> 2. Plate Beläggning <ol><li> Coat plattor med gelatin: Lägg till 2,5 ml / brunn av gelatin lösning till 6 brunnar och inkubera över natten i ett 37 ° C fuktig kuvös. </li><li> Coat plattor med laminin: chill gelatin-plåt och ta bort gelatin, tillsätt 2,5 ml / brunn Matrigel eller mänskliga laminin beläggning fungerande lösning till redan kylda gelatiniserad 6-brunnar och inkubera vid 4 ° C över natten. </li></ol> 3. Passaging och såmaskiner diverse hESCs fastställda villkor <ol><li> Låt hESC kolonier växa till 5-7 dagar gammal, och ta plattan hESC kultur att dissekera mikroskop (förvärma dissekera steg till 37 ° C) under dissekera steriliserade huva. </li><li> Välj hESC kolonier ska delas. Morfologiskt bör dessa kolonier har&gt; 75% odifferentierade hESCs (små kompakta celler), vanligen något ogenomskinlig (inte vit-uppstaplade celler, inte klart differentierade celler) med definierade kanter underneath de dissekera mikroskop. Noggrant beskriva de utvalda kolonierna och ta bort differentierade fibroblast skikt som omger kolonin och alla differentierade delar (om någon) av kolonin med kanten av P2 steril pipettspetsen eller dras glas kapillär. (Observera, pluripotenta hESCs är i en övergående fas, genomgår spontan differentiering även under optimala förhållanden, men att föredra, är det svårt att avgöra avhandlingar celler är 100% odifferentierade i dissekera mikroskop,&gt; 75% odifferentierade brukar betraktas som passerar punkt. differentierade celler vanligen inte utsäde och fortsätter att växa, elimineras i passaging processen) </li><li> Ta bort den gamla medierna som innehåller flytande loss differentierade celler genom att aspirera. Tvätta med hESC medier (utan bFGF) en gång. Tillsätt 3 ml / brunn färska media hESC innehållande 20 ng / ml bFGF. </li><li> Skär den odifferentierade hESC kolonierna i små bitar, och ta med sterila pipetten eller dras glas kapillär.</li><li> Pool media innehåller friliggande kolonin ihop i en 50 ml koniska rör. Tvätta plattan en gång med 1 ml / brunn media hESC innehållande 20 ng / ml bFGF och pool tillsammans. </li><li> Aspirera Matrigel eller mänskliga laminin lösning från belagd färska plattorna. Alikvotera 4 ml / brunn hESC media som innehåller koloni bitar till en 6-brunnar. Försiktigt överföra plattan till inkubatorn utan att skaka och låt koloni stycken frön över natten utan att störa i en fuktig 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO 2. </li></ol> 4. Neurala Induktion av hESCs under definierade kultur-system med retinoinsyra <ol><li> Dag 3 efter sådd, bort det mesta av gamla medier från varje brunn i plattan och lämna tillräckligt media för att hESC kolonier att vara nedsänkt (aldrig tillåta hESCs torka ut). Ersätt med 4 ml / brunn färska hESC media som innehåller 20 ng / ml bFGF och 10 mikroM retinoinsyra. </li><li> Byt ut gamla medier med färska hESC media som innehåller 20 ng / ml bFGF och10 mikroM retinoinsyra varannan dag, och tillåta neurala-inducerad hESC kolonier växer till dag 7 eller 8. Alla celler i kolonin kommer att genomgå morfologi ändras till stora differentierade celler som kommer att fortsätta att föröka sig. Kolonierna kommer att öka i storlek för att täcka plattan för dag 7 eller 8, och celler som kommer att börja stapla upp i vissa områden av kolonierna. </li></ol> 5. Fortsatta neuronal differentiering i suspension Kultur <ol><li> Ta tallrik hESC kultur att dissekera mikroskop (förvärma dissekera steg till 37 ° C) under dissekera steriliserade huva. Försiktigt beskriva kolonierna och ta bort fibroblast skikt som omger kolonin (differentierade celler migrerat ut från kolonin) med kanten av P2 steril pipettspetsen eller dras glas kapillär. </li><li> Ta bort den gamla medierna som innehåller flytande loss fibroblast celler genom aspirera. Tvätta med hESC medier (utan bFGF) en gång. Tillsätt 3 ml / brunn färska medier hESC (utan bFGF). </li><li> Skär neurala-induced hESC kolonier i små bitar, och ta med sterila pipetten eller dras glas kapillär. </li><li> Pool media innehåller friliggande kolonin ihop i en 50 ml koniska rör. Tvätta plattan en gång med 1 ml / brunn media hESC (utan bFGF) och pool tillsammans. </li><li> Alikvotera 4 ml / brunn serumfritt hESC media som innehåller koloni bitar till en 6-väl ultralåga fästplatta och inkubera vid 37 ° C fuktas inkubator för att flytande cellulär kluster (neuroblaster) för att bilda i 4-5 dagar. </li></ol> 6. Neuronal Fenotyp mognad i Självhäftande Kultur <ol><li> Pool media som innehåller flytande neuroblaster tillsammans i en 50 ml koniska rör. Centrifugera vid 1400 rpm i 5 min. Sug den gamla media så mycket du kan och lägga lika mycket färska NSC media som innehåller VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) och BDNF (10 ng / ml). </li><li> Pipettera upp och ner för att blanda flytande neuroblaster och delprov 4 ml / brunn till 6-bra plattor. Den neuroblaster kan också seeded i en laminin / kollagen (Matrigel) eller mänsklig laminin polymeriserade 3-dimensionell matris i serum-fri NSC media som innehåller VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) och BDNF (10 ng / ml) . Överför plattorna till 37 ° C fuktas inkubator för att neuroblaster att fästa över natten. </li><li> Byt NSC media som innehåller VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) och BDNF (10 ng / ml) varannan dag. Omfattande nätverk av neurite bärande neuronala celler och pigmenterade celler kommer att börja visas inom 2 veckor med kontinuerlig odling och öka i antal med tiden, och kunde upprätthållas i över 3 månader. </li></ol> 7. Representativa resultat: Retinoinsyra (RA) återges tillräckligt för att framkalla hESCs upprätthålls i definierade kultur för att övergången från pluripotens uteslutande till en neuroektodermal fenotyp (Fig. 2A). Vid exponering av odifferentierade hESCs till RA kommer alla celler i kolonin genomgå morfologi förändringarstora differentierade celler som upphör uttrycker pluripotens-relaterade markörer, vilket framgår av oktober-4, och börja uttrycka olika neuroectoderm-relaterade markörer, såsom HNK1, AP2 och TrkC (Fig. 2B). Dessa stora differentierade celler kommer att fortsätta att föröka sig och kolonierna kommer att öka i storlek, fortsätter spontant uttrycka det tidiga neuronala markör β-III-tubulin (Fig. 2B). De mer mogna neuronal markör Karta-2 kommer att börja synas i områden i kolonierna där cellerna har staplat upp (Fig. 2B). Sammanfaller med utseendet på neuroektodermal celler och neuronal differentiering kommer neuronala specifika transkriptionell faktor Nurr1, inblandad i dopaminerga neuronal differentiering och aktivering av tyrosin hydroxylas (TH) genen 16, translocate till kärnan (Fig. 2B). Efter lossnat kommer de RA-behandlade hESCs bilda flytande cellulär kluster (neuroblaster) i en suspension kulture att fortsätta neurala differentiering processen. Vid borttagning av bFGF och efter tillåter neuroblaster att fästa en vävnadsodling tallrik eller seedade i ett laminin / kollagen polymeriserade 3-dimensionell matris i en definierad serumfritt medium, β-III-tubulin-och Map-2-uttryckande, neurite bärande celler och pigmenterade celler kommer att börja visas med en drastisk ökning i effektivitet jämfört med spontan flera härstamning differentiering av hESCs utan behandling under samma tidsperiod, och kunde upprätthållas i över 3 månader (Fig. 2C). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> Figur 1 En schematisk av de välkontrollerade effektiv induktion av mänskliga pluripotenta stamceller enbart till ett visst kliniskt relevant härstamning genom en enkel tillhandahållande av små molekyler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> Figur 2 <strong&gt; Retinoinsyra inducerar neurala härstamning specifikation och neuronala progression direkt av pluripotens under definierade förhållanden. (A) Schematisk skildrar i protokollet tiden raden av riktade neuronal differentiering av hESCs. (B) vid exponering av odifferentierade hESCs till retinoinsyra (RA) under definierade kultur-systemet, stora differentierade oktober-4 (röd) negativ celler i kolonin började dyka upp, jämfört med mock-behandlade (DMSO) hESCs som kontroll . RA-inducerad differentierade oktober-4-negativa celler började uttrycka HNK-1 (röd), AP2 (röd), TrkC (grön) och β-III-tubulin (röd), i linje med tidiga neuroektodermal differentiering. Dessa celler har fortsatt att mogna slutligen uttrycka neuronala markör Map-2 (grön), oftast i områden där cellerna började stapla upp. Sammanfaller med utseendet på neuroektodermal celler och neuronal differentiering, den neuronala specifika transkriptionell faktor Nurr1 (grön), inblandad idopaminerga neuronal differentiering och aktivering av tyrosin hydroxylas (TH) genen, flyttas till kärnan. Alla celler visas med DAPI färgning av sina kärnor (blå). (C) RA behandling inducerar differentiering mot en neuronal härstamning med hög verkningsgrad enligt bedömning av omfattande nätverk av neurite-bärande celler som uttrycker β-III-tubulin (röd) och Map-2 (grön, visas i en 3-dimentional matris). Pilarna anger pigmenterade celler som är typiska för de i CNS. Alla celler visas med DAPI färgning av sina kärnor (blå) i inläggningar. Skala staplar: 0,1 mm.

<ol>
	<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+improvement+in+a+primate+Parkinson's+model+is+associated+with+multiple+homeostatic+effects+of+human+neural+stem+cells.">Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).</li><li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells.">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nature Rev. 7, 395-406 (2006).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Br&#252;stle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage.">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain. Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., S&#252;dhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Författarna förklarar konkurrerande intressen. XHP är grundare av Xcelthera. XHP och EYS har intellektuella egenskaper relaterade till hESCs.

En av de stora utmaningar för både utvecklingsstudie och kliniska översättningen har varit att kanalisera de breda differentiering potential pluripotenta mänskliga stamceller till önskad fenotyp effektivt och förutsägbart. Även om sådana celler kan skilja spontant in vitro i celler av alla groddblad genom att gå igenom en flera härstamning samlade skede, bara en bråkdel av celler utöva ett visst släktskap 1,4. I de hESC-derived aggregat gör samtidiga en stor mängd vitt skilda oönskade celltyper som kan finnas i tre embryonala groddblad ofta uppkomsten av önskade fenotyper inte bara ineffektivt, men okontrollerbara och opålitliga också. Även hjärt-och neurala linjerna har härletts i tidigare rapporter, men ineffektiviteten generera specialiserade celler genom könsceller lager-induktion av pluripotenta celler och hög risk för tumorigenicitetsprov följande transplantation ha hindrat ytterligare kliniska översättning. Den hESC linjer ursprungligen härstammar och underhålls i samarbete kultur med tillväxt-greps möss embryonala fibroblaster (MEFs) 4. Trots att flera människor feeder, matare-fri, och kemiskt formulerade system kulturen har utvecklats för hESCs 11-13, elementen är nödvändig och tillräcklig för att upprätthålla den självförnyelse för mänskliga pluripotenta celler förblir olösta. Dessa exogena feeder celler och biologiska reagens bidra till att upprätthålla långsiktigt stabil tillväxt av odifferentierade hESCs medan masken förmåga pluripotenta celler att reagera på utvecklings-signaler. Att upprätthålla odifferentierade hESCs i ett definierat biologiska-fri kultur som gör det möjligt trogna expansion och kontrollerbar direkt differentiering är en av nycklarna till deras terapeutiska nyttan och potential. RA var inte tillräcklig för att framkalla neuronal differentiering av odifferentierade hESCs upprätthålls enligt tidigare redovisade Conditjoner innehåller exogena feeder celler. Även om neurala linjer visas på ett relativt tidigt skede i hESC differentiering, behandla hESC differentierade flera härstamning aggregat (embryoid organ) med RA endast marginellt ökat den låga avkastningen av nervceller 1, 14, 15. För att uppnå enhetligt konvertering av mänskliga pluripotenta stamceller till en viss härstamning, anställde vi en definierad kultur system som kan försäkra spridning av odifferentierade hESCs att identifiera förutsättningar för välkontrollerade effektiv induktion av pluripotenta hESCs enbart till ett visst kliniskt relevant härstamning genom en enkel tillhandahållande av små molekyler (Fig. 1, Fig.. 2). Framtida studier kommer att avslöja genetiska och epigenetiska kontroll molekyler i människans CNS utveckling som alternativ, vilket kan bana väg för liten molekyl-medierad direkt kontroll och modulering av hESC pluripotenta öde när härrör kliniskt relevanta linjer för regenerativ terapi. Utan RA behandling, 1-5% HESCs kommer att genomgå spontan differentiering till nervceller 1, 14, 15. Med RA behandling, har vi kunnat generera&gt; 95% embryonala neuronala stamceller och nervceller från hESCs bibehålls som ett definiera kulturen i en process som kan efterlikna mänskliga embryonala utvecklingen 14. Nyligen har känt neurala-ödet bestämma gener använts för att transdifferentiate musfibroblaster i vuxen neurala stamceller och nervceller med en låg verkningsgrad på mellan 0,5-8% 17, 18. Dock har omprogrammeras kroppsceller historiskt förknippats med onormalt genuttryck och accelererat åldrande med nedsatt terapeutiska nyttan 19-21. Slutligen är det protokoll som vi etablerat här begränsat till pluripotenta hESCs härrör från den inre cellmassan (ICM) eller epiblast av den mänskliga blastocysten 4 får inte tillämpas på andra pluripotenta celler, inklusive djur har sitt ursprung ekonomiska och sociala råd, ekonomiska och sociala råden från tidigare Morula (åtta -cell)-stadiet embryon 22, och Artificially omprogrammerade celler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (tillval) </th></tr><tr><td> Gelatin </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356.231 </td><td> Tillväxtfaktor minskas </td></tr><tr><td> Mänskliga laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> all-trans-vitamin A syra </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum ersättning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM onödiga aminosyra-lösning (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM ettMino syror lösning (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsyra </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Humant insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga Activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF-450 till 02 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-1 till 200 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga NT-3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </tD&gt; <td> Sigma </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 tillägg (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6-väl ultralåga fästplatta </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-brunnar </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Det finns ett stort ouppfyllda behov av ett kliniskt lämpligt mänskliga neuronala celler källa för reparation eller förnyelse av de skadade centrala nervsystemet (CNS) struktur och kretsar i dagens sjukvården. Cellbaserade terapier är mycket lovande för att återställa förlorad nervvävnad och funktion för CNS-sjukdomar. Dock har cellterapi bygger på CNS härstammar-neurala stamceller stött på utbudet restriktioner och svårigheter att använda i klinisk miljö på grund av deras begränsade expansionen förmåga i kultur och i avsaknad av plasticitet efter omfattande passaging 1-3. Trots vissa positiva resultat, CNS-derived mänskliga neurala stamceller (hNSCs) förefaller utöva sina terapeutiska effekter främst genom sin icke-neuronala avkommor genom att producera trofiska och nervskyddande molekyler för att rädda den endogena celler 1-3. Alternativt pluripotenta mänskliga embryonala stamceller (hESCs) proffer botemedel för ett brett spektrum av neurologiska störningar av supplying den mångfald av mänskliga neuronala celltyper i utvecklingsländerna CNS för regenerering 1,4-7. Men hur har att kanalisera det stora differentiering potential pluripotenta hESCs effektivt och förutsägbart till en önskad fenotyp varit en stor utmaning för både utvecklings-studier och kliniska översättning. Konventionella metoder är beroende av flera härstamning lutning pluripotenta celler genom spontana könsceller lager differentiering, vilket resulterar i ineffektiva och okontrollerbar härstamning-engagemang som ofta följs av fenotypisk heterogenitet och instabilitet därmed en stor risk för tumorigenicitetsprov 7-10. Dessutom kan odefinierade utländska / djur biologiska kosttillskott och / eller matare som vanligen har använts för isolering, expansion och differentiering av hESCs direkt använder sådan cell-specialiserade kneg hos patienter problematiskt 11-13. För att övervinna dessa hinder, vi har löst delar av ett definierat kultur som är nödvändiga och tillräckliga för sustaining den epiblast pluripotence av hESCs, fungerar som en plattform för de novo härledning av kliniskt lämplig hESCs och effektivt styra ett sådant hESCs jämnt mot kliniskt relevant härstamningar av små molekyler 14 (se ett schema i bild. 1). Retinoinsyra (RA) inducerar inte neuronal differentiering av odifferentierade hESCs underhållas på matare 1, 14. Och till skillnad från mus ekonomiska och sociala råd, behandlar hESC differentierade embryoid organ (EBS) endast marginellt ökar låg avkastning av nervceller 1, 14, 15. Men, efter säkerhetskontroll en mängd små molekyler och tillväxtfaktorer, fann vi att dessa definierade villkor återges retinoinsyra (RA) är tillräcklig för att framkalla specifikationen av neuroectoderm direkt från pluripotenta hESCs att ytterligare utvecklats till neuroblaster som genereras mänskliga neuronala stamceller och nervceller i utveckla CNS med hög verkningsgrad (bild 2). Vi fastställda villkor för induktion av neuroblaster direkt från pluripotenta hESCs utan en mellanliggande flera härstamning embryoid kroppen skede, så välkontrollerad effektiv härledning av ett stort utbud av mänskliga neuronala celler inom hela spektrumet av utvecklingsstadier för cell-baserad terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Vi har etablerat ett protokoll för induktion av neuroblaster direkt från pluripotenta mänskliga embryonala stamceller som upprätthålls enligt fastställda villkor med små molekyler, vilket möjliggör härledning av ett stort utbud av mänskliga neuronala stamceller och neuronala celltyper i utvecklingsländerna CNS för neurala reparation.

Effektiv Derivering av mänskliga neurala stamceller och nervceller från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder fria Härledning av neurallisten progenitorceller från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Riktad dopaminerga nerv Differentiering från Human pluripotenta stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Härledning av Leptomeninges Explantation kulturer från obduktions Human Brain Donatorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primär kultur av neuroner isolerade från embryonala mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering från mus embryonala stamceller in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...