Name: efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

XHP er blevet støttet af National Institute of Health (NIH) tilskud fra National Institute on Aging (NIHK01AG024496) og The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

1. Løsning og medier Forberedelse <ol><li> Gelatine belægning løsning: 0,1% (w / v) gelatine i Hedeselskabet 2 O, autoklaveres og opbevares ved 4 ° C. </li><li> Matrigel coating løsninger. Stamopløsning: langsom optøning Matrigel (10 ml) ved 4 ° C natten over, tilsæt 10 ml iskold DMEM eller DMEM/F12, bland godt og alikvot 1 ml / rør nedenunder steriliseret vævskultur hætte, opbevares ved -20 ° C. Arbejde løsning: langsom optøning 1 ml Matrigel alikvot ved 4 ° C i 1-2 timer, overføres til 14 ml kølet DMEM eller DMEM/F12 og bland det godt nedenunder steriliseret vævskultur hætte umiddelbart før belægning. </li><li> Menneskelige laminin belægning opløsning: 1 ml human laminin opløsning (0,5 mg / ml i Tris buffered NaCl, opbevares ved -80 ° C, langsomt tø op ved 4 ° C i 1-2 time) med iskolde DMEM eller DMEM/F12 til 12,5 ml brugsopløsning (40 mg / ml) under steriliseret vævskultur hætte umiddelbart før belægning. </li><li> Vækstfaktor stamopløsninger (500-1000x): opløses vækstfaktor på 10 mikrogram/ Ml i steriliseret buffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycerol, 1XPBS) og gemmes som 50-100 μl / rør alikvoter ved -80 ° C. </li><li> HESC medier: DMEM/F12 eller KO-DMEM (80%), KO serum udskiftning (20%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MEM uvæsentlige aminosyrer (MNAA, 1X), og β-mercaptoethanol (100 mM), filtreres og opbevares ved 4 ° C, suppleret med 20 ng / ml bFGF før brug. Eller at erstatte &quot;KO serum udskiftning&quot; med definerede komponenter: DMEM/F12 eller KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essentielle aminosyrer (MEAA , 1X), og β-mercaptoethanol (100 mM), filtreres og opbevares ved 4 ° C, suppleret med bFGF (20 ng / ml), human insulin (20 mg / ml), askorbinsyre (50 mg / ml), menneskelige activin A (50 ng / ml), human albumin / Albumax (10 mg / ml), og menneskelige transferrin (8 mg / ml) før brug. </li><li> HESC hjerte differentiering medier: DMEM/F12 (90%), defineret FBS (10%), og L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm). </li><li> Medier, der indeholder nicotinamid (NAM): Add NAM til HESC medier eller HESC hjerte differentiering medier til den endelige koncentration på 10 mM, filtreret, opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for 2 ugers forberedelse. </li></ol> 2. Plate Coating <ol><li> Coat plader med gelatine: Tilsæt 2,5 ml / hul gelatine løsning til 6 samt plader og inkuber natten over i et 37 ° C fugtet inkubator. </li><li> Coat plader med laminin: chill gelatine-plader og fjerne gelatine, tilsættes 2,5 ml / hul Matrigel eller menneskelige laminin belægning brugsopløsning til at pre-kølet gelatinized 6-godt plader og inkuberes ved 4 ° C natten over. </li></ol> 3. Passaging og såning Private husholdningers hESCs under definerede betingelser <ol><li> Tillad hESC kolonier vokse til 5-7 dage gamle, og tage hESC agarplade til dissektionsmikroskop (præ-varme dissekere fase til 37 ° C) under dissekering steriliseret hætte. </li><li> Vælg hESC kolonier skal opdeles. Morfologisk, bør disse kolonier er&gt; 75% udifferentierede hESCs (smalle kompakte celler), som regel svagt uigennemsigtig, (ikke hvid-opstablede celler, ikke klart-opdelte celler) med definerede kant under dissektionsmikroskop. Omhyggeligt skitsere de udvalgte kolonier og fjerne differentieret fibroblast lag omkring koloni og alle differentierede dele (hvis nogen) i kolonien med kanten af ​​P2 steril pipette spids eller trukket glas kapillar. </li><li> Fjern de gamle medier, der indeholder flydende løsrevne differentierede celler ved sugning. Vask med hESC medier (uden bFGF) én gang. Tilsæt 3 ml / hul frisk hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF. </li><li> Skær udifferentierede hESC kolonier i små stykker, og tag med steril pipette spids eller trukket glas kapillar. </li><li> Pool medierne indeholder fritliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk rør. Vask pladen en gang med 1 ml / hul hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF og samle. </li><li> Aspirer den Matrigel eller mennesker laminin løsning fra det coatede friske plader. Alikvot 4 ml / hul hESC medier indeholdende koloni brikker til et 6-brønds plade. Forsigtigt overføre pladen til inkubator uden at ryste, og lad koloni stykker frø natten uden at forstyrre i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære på 5% CO 2. </li></ol> 4. Cardiac Induktion af hESCs under definerede kultur System med nicotinamid <ol><li> På dag 3 efter såning, fjerne de fleste af de gamle medier fra hver brønd af pladen og lad nok medier til at tillade hESC kolonier at blive oversvømmet (aldrig tillade hESCs at tørre ud). Udskift med 4 ml / hul frisk hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF og 10 mm nicotinamid (NAM). </li><li> Udskift gamle medier med frisk hESC medier, der indeholder 20 ng / ml bFGF og 10 mM NAM hver anden dag, og lad hjerte-induceret hESC kolonier vokse til dag 8-10. Ved udsættelse for NAM, vil alle celler i kolonien gennemgå morfologi ændringer i store differentierede celler, der vil fortsætte med at formere sig. Kolonierne vil stige i størrelse, og efter dag 8-10, end celler vil begynde at hobe sig op i nogle områder af kolonierne. </li></ol> 5. Fortsat Cardiac Differentiering i suspension kultur <ol><li> Tag hESC agarplade til dissektionsmikroskop (præ-varme dissekere fase til 37 ° C) under dissekering steriliseret hætte. Forsigtigt skitsere de kolonier og fjern fibroblast lag omkring koloni (differentierede celler migreret ud af koloni) med kanten af ​​P2 steril pipette spids eller trukket glas kapillar. </li><li> Fjern de gamle medier, der indeholder flydende løsrevne fibroblastceller ved sugning. Vask med hESC medier (uden bFGF) én gang. Tilsæt 3 ml / hul frisk hESC medier (uden bFGF). </li><li> Skær hjerte-induceret hESC kolonier i små stykker, og tag med steril pipette spids eller trukket glas kapillar. </li><li> Pool medierne indeholder fritliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk rør. Vask pladen en gang med 1 ml / hul hESC medier (uden bFGF) og samle. </li><li> Alikvot 4 ml / hul serumfrit hESC medier, der indeholder koloni brikker til et 6-vel ultralow vedhæftet pladen og inkuber i et 37 ° C fugtet inkubator for at tillade flydende cellulære klynger (cardioblasts) til at danne i 4-5 dage. </li></ol> 6. Slå Cardiomyocyte Fænotype modning i Adhesive Kultur <ol><li> Pool de medier, der indeholder flydende cardioblasts sammen i en 50 ml konisk rør. Centrifuger ved 1400 rpm i 5 min. Aspirer de gamle medier så meget som du kan og tilføje lige mængden af ​​frisk hESC hjerte differentiering medier, der indeholder 10 mM NAM. </li><li> Pipette op og ned for at blande flydende cardioblasts og alikvot 4 ml / hul til 6-godt plader. Overførsel pladerne til en 37 ° C fugtet inkubator for at tillade cardioblasts at vedhæfte natten over. </li><li> Udskift hESC hjerte differentiering medier, der indeholder 10 mM NAM hver anden dag. </li><li> På dag 8, erstat med hESC hjerte differentiering medier uden NAM, og fortsætte med at erstatte HESC hjerte differentiering medier emeget anden dag. Slå cardiomyocytter vil begynde at dukke op i omkring 1-2 uger kontinuerlig dyrkning efter tilbagetrækning af NAM og stigning i antallet med tiden, og kunne fastholde stærke og rytmiske sammentrækninger i over 3 måneder. </li></ol> 7. Repræsentative resultater: Nicotinamid (NAM) er gjort tilstrækkelig til at fremkalde hESCs bibeholdes i den definerede kultur-systemet til at skifte fra pluripotency udelukkende til en cardiomesodermal fænotype (Fig. 2B). Ved eksponering af udifferentieret hESCs til NAM, vil alle celler i kolonien gennemgå morfologi ændringer i store differentierede celler, der nedregulere ekspressionen af ​​oktober-4 og begynder at udtrykke hjertets specifikke transskription faktor (CSX) Nkx2.5 og α- actinin, i overensstemmelse med en cardiomesoderm fænotype (Fig. 2B). Disse differentierede celler vil fortsætte med at formere sig og kolonierne stigningen i størrelse. Øget intensitet Nkx2.5 vilnormalt være observeret i områder af kolonier, hvor cellerne begynder at hobe sig op (Fig. 2B). Efter fritliggende vil NAM-behandlede hESCs form, flydende cellulære klynger (cardioblasts) i en suspension kultur at fortsætte hjerte differentiering processen. Efter tillader cardioblasts at vedhæfte og fortsætte med at behandle med NAM for 1 uge, vil slå cardiomyocytter begynder at dukke op i omkring 1-2 uger kontinuerlig dyrkning efter tilbagetrækningen af ​​NAM med en drastisk stigning i effektiviteten i forhold til spontan multi-afstamning differentiering af hESCs uden behandling i samme periode (Fig. 2C). Celler i at slå cardiomyocyte klynger vil udtrykke markører karakteristisk for cardiomyocytter, herunder Nkx2.5 og α-actinin (Fig. 2C). Det sammentrækninger af det bankende cardiomyocytter blev bekræftet af elektriske profiler at være stærke, rytmiske, velkoordineret, og godt indblandet, med regelmæssige impulser minder om p-QRS-T-komplekser set fra kroppens overflade elektroder i klinisk elektrokardiogram (Fig. 2C, også se video). Den cardiomyocytter vil kunne bevare deres stærke kontraktilitet i over 3 måneder. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Figur 1. Samlet ordninger konventionelle tilgang versus små-molekyle-induktion tilgang til differentiering af menneskelige pluripotente stamceller i retning af specialiserede funktionelle celler. (A) En skematisk af konventionelle tilgang med multi-slægt hældning af menneskelige pluripotente stamceller gennem spontane kimlag differentiering. (B) En skematisk af velkontrollerede effektiv induktion af menneskelige pluripotente stamceller udelukkende til en bestemt klinisk relevante slægtslinje ved simpel bestemmelse af små molekyler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Figur 2. Nicotinamid fremkalder hjerte-slægt specifikation direkte af pluripotency under definerede betingelser og progression i retning af at slå cardiomyocytter. (A) Skematisk skildrer af protokollen tidslinje for dirigerede hjerte-differentiering af hESCs. (B) Ved eksponering af udifferentierede hESCs til nicotinamid (NAM) under den definerede kultur-systemet, store differentierede oktober-4 (rød) negative celler i kolonien begyndte at dukke op, i forhold til mock-behandlede (DMSO) hESCs som kontrol. NAM-induceret oktober-4-negative celler begyndte at udtrykke Nkx2.5 (grøn) og α-actinin (rød), i overensstemmelse med tidlig hjerte-differentiering. Gradvist øget intensiteten af ​​Nkx2.5 blev normalt observeret i områder af kolonien, hvor cellerne begyndte at hobe sig op. Alle celler er markeret med DAPI farvning af deres kerner (blå). (C) NAM-kardielle-engagerede hESCs gav slå cardiomyocytter med en drastisk stigning i effektiviteten, som vurderet af Det cellulære klyngerbreve, som viste rytmiske sammentrækninger (se elektrofysiologiske profil og videoer), og immunopositive for Nkx2.5 (grøn) og α-actinin (rød). Fase billeder af repræsentative store slå cardiomyocyte klynger og højere magt billeder af repræsentative ordregivende hjerte muskler er vist (se også tilsvarende videoer). Pile angiver det store at slå cardiomyocyte klynge bruges til elektrofysiologiske optagelse. Elektrofysiologiske profil slå cardiomyocytter viser regelmæssig, indblandet, rytmiske impulser minder om p-QRS-T-komplekser set i kliniske elektrokardiogrammer. Skala stænger: 0,1 mm. Videoer: kontraherende cardiomyocytter differentieret fra NAM-induceret hESCs. Videoer 1 og 2 viser repræsentative store slå cardiomyocyte klynger i ca 1 og 3 måneder efter vedhæftede fil. Video 3 og 4 viser repræsentative ordregivende hjerte-muskler ved højere magt. Video 5 viser et typical lille slå cardiomyocyte klynge spontant differentieret fra hESCs uden NAM behandling som kontrol. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Klik her for at se video 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Klik her for at se Video 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Klik her for at se Video 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Klik her for at se Video 4.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Klik her for at se video-5.</a>

<ol>
	<li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering:+a+review.">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li><li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li><li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair.">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li><li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li><li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+transcription+factor+Csx/Nkx2-5:+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases.">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li><li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li><li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy.">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Forfatterne erklærer konkurrerende interesser. XHP er grundlægger af Xcelthera. XHP og Eys har intellektuelle egenskaber relateret til hESCs.

En af de store udfordringer for både udviklings-studier og klinisk oversættelsen har været, hvordan at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente menneskelige stamceller til en ønsket fænotype effektivt og forudsigeligt. Selv om sådanne celler kan differentiere spontant in vitro i celler af alle kim lag ved at gå gennem et multi-slægt samlet fase i hESC-afledte multi-slægt aggregater (embryoid organer), kun en meget lille brøkdel af celler (&lt;2%) spontant differentiere sig til cardiomyocytter 13-15 (Fig. 1A). Efter immunoselection, at beriget populationer af cardiomyocytter var i stand til at fungere som biologisk pacemaker at redde funktionen af en beskadiget myokardiet mekanisk og elektronisk efter injektionen ind i hjertet af dyremodeller 13. I gnaver infarcted modeller blev indpodet hESC-afledte hjerte afkom i stand til at overleve og modne op til 12 uger, og delvist remuscularize den skadede hjertet og forbedre den kontraktile funktion 14,15. Imidlertid har den manglende effektivitet i at skabe menneskelige hjerte-engagerede celler gennem multi-slægtslinje differentiering af pluripotente celler og den store risiko for tumorgenicitet efter transplantation hindret yderligere kliniske oversættelse. Udvikling af strategier til at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente hESCs udelukkende og forudsigeligt til en kardiologisk fænotype er vigtigt at udnytte kraften i hESC biologi i hjertet området. For at opnå ensartet konvertering af menneskelige pluripotente stamceller til en bestemt slægt, har vi ansat en defineret kultur system, der kan forsikre spredning af udifferentierede hESCs at identificere vilkårene for velkontrolleret effektiv induktion af pluripotente hESCs udelukkende til en bestemt klinisk relevant afstamning ved simpel bestemmelse af små molekyler (Fig. 1B). Vi fandt, at nikotinamid kardielle-slægt engagement direkte fra Pluripotent hESCs under definerede kultur, at yderligere udviklet sig til at slå cardiomyocytter med høj effektivitet (fig. 2). Nkx2.5 er en evolutionally bevaret homeobox transkriptionsfaktor uundværlig for normal hjertefunktion udvikling og mutationer af genet er forbundet med menneskelig medfødt hjertesygdom (CHD), den mest almindelige menneskelige fødselsskade 16. Angivelse af Nkx2.5 er den tidligste markør for hjerte precursor celler i alle hvirveldyr hidtil undersøgt og er afgørende for korrekt hjerte septation og dannelse / modning af elektriske ledningssystem 16. I hvirveldyr, omtrent det debut og mønster af tidlig Nkx2.5 udtryk falder sammen med timingen og areal hjerte-specifikation i begyndelsen af embryogenese, og Nkx2.5 gen fortsætter med at komme til udtryk gennem udvikling i hjertet 16. I vores hESC model, syntes NAM at udløse hjertets induktion direkte fra pluripotente hESCs ved at fremme ekspressionen af ​​hjerte-specifikke transcription faktor Nkx2.5 i en proces, der kan emulere specifikation af cardiomesoderm fra pluripotente epiblast i humane embryonale cardiogenesis. Fremtidige undersøgelser vil afsløre genetiske og epigenetiske kontrol molekyler i menneskets hjerte udvikling som alternativer, der kan bane vejen for småmolekyle-medieret direkte kontrol og modulering af hESC pluripotente skæbne, når der følger klinisk relevant slægter for regenerativ terapi. Uden NAM behandling, vil &lt;2% hESCs undergå spontan differentiering i at slå cardiomyocytter 12-15. Med NAM behandling, har vi været i stand til at generere&gt; 95% embryonale hjerte prækursorer og&gt; 50% at slå cardiomyocytter fra hESCs vedligeholdes under en definerer kultur i en proces, der kan emulere humane embryonale hjerte udvikling 12. For nylig har kendt hjerte-skæbne afgørende gener blevet brugt til at transdifferentiate muse fibroblaster i postnatale slå cardiomyocytter med en lav effektivitet på &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Imidlertid har omprogrammeret somatiske celler historisk set været forbundet med unormal genekspression og accelereret ældning med nedsat terapeutisk værktøj 19-21. Endelig er den protokol, vi etableret her begrænset til pluripotente hESCs stammer fra den indre cellemasse (ICM) eller epiblast den menneskelige blastocyst 4,5, gælder måske ikke for andre pluripotente celler, herunder animalsk oprindelse økonomiske og sociale råd, økonomiske og sociale råd stammer fra tidligere morula (otte-celle)-fase embryoner 22, og kunstigt omprogrammeret celler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Navn på reagenset </th><th> Firma </th><th> Katalog nummer </th><th> Kommentarer (valgfri) </th></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Vækstfaktor reduceret </td></tr><tr><td> Menneskelige laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum udskiftning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM uvæsentlige aminosyre opløsning (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminosyrer opløsning (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbinsyre </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelige activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Defineret FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-godt ultralow vedhæftet fil plade </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-brønds plade </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Til dato, har manglen på en passende menneskelige hjerte-celle kilde været alvorligt tilbageslag med at regenerere den menneskelige myokardiet, enten ved at cellebaserede transplantation eller hjerte-tissue engineering 1-3. Cardiomyocytter bliver uhelbredeligt-opdelte kort efter fødslen og mister deres evne til at formere sig. Der er ingen beviser for, at stamceller / stamceller fra andre kilder, såsom knoglemarv eller navlestrengsblod, kan give anledning til kontraktile hjertemuskelcellerne efter transplantation ind i hjertet 1-3. Behovet for at regenerere eller reparere beskadigede hjertemusklen er ikke blevet mødt af voksne stamceller terapi, enten endogene eller via celle levering 1-3. Den genetisk stabile humane embryonale stamceller (hESCs) har ubegrænset ekspansion evne og ubegrænset plasticitet, proffering en pluripotente reservoir for in vitro afledning af store forsyninger af humane somatiske celler, der er begrænset til den slægt, der har brugaf reparation og regenerering 4,5. På grund af forekomsten af ​​hjerte-kar-sygdomme på verdensplan og akut mangel på donororganer, der er en intens interesse for at udvikle hESC-baserede terapier som en alternativ fremgangsmåde. Men hvordan har at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente hESCs effektivt og forudsigeligt til en ønsket fænotype været en stor udfordring for både udviklings-studier og kliniske oversættelse. Konventionelle metoder stole på multi-slægt hældning af pluripotente celler gennem spontane kimlag differentiering, hvilket resulterer i en ineffektiv og ukontrollabel slægt-engagement, der ofte efterfølges af fænotypiske heterogenitet og ustabilitet dermed en høj risiko for tumorgenicitet 6-8 (se skematisk i Fig. 1A). Herudover kan udefinerede udenlandske / dyre biologiske kosttilskud og / eller foderautomater, der har typisk været anvendt til isolering, ekspansion, og differentiering af hESCs gøre direkte brug af disse celle-specialiZed podninger hos patienter problematisk 9-11. For at overvinde disse forhindringer har vi løst de elementer af en defineret kultur, der er nødvendige og tilstrækkelige for at opretholde den epiblast pluripotence af hESCs, der tjener som en platform for de novo afledningen af klinisk-egnede hESCs og effektivt lede sådanne hESCs ensartet retning af klinisk relevant slægter af små molekyler 12 (se en skematisk i Fig. 1B). Efter screening en række af små molekyler og vækstfaktorer, fandt vi, at disse definerede betingelser gengives nikotinamid (NAM) tilstrækkelig til at fremkalde specifikationen af cardiomesoderm direkte fra pluripotente hESCs at yderligere udviklet sig til cardioblasts, der har genereret menneskelige slå cardiomyocytter med høj effektivitet (fig. 2 ). Vi definerede betingelser for induktion af cardioblasts direkte fra pluripotente hESCs uden mellemliggende multi-slægt embryoid krop scenen, så velkontrolleret effektiv afledning af enstore udbud af menneskelige hjerte-celler i hele spektret af udviklingsstadier for celle-baseret terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Vi har etableret en protokol til induktion af cardioblasts direkte fra pluripotente menneskelige embryonale stamceller opretholdes under definerede betingelser med små molekyler, som giver udledning af et stort udbud af menneskets hjerte stamceller og funktionelle cardiomyocytter for hjerte-kar-reparation.

Effektiv Udledning af menneskelige Hjerte prækursorer og cardiomyocytter fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Udarbejdelse af muse embryonale fibroblastceller anvendes til dyrkning af menneskelige embryoner og induceret pluripotente stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Hurtig og effektiv generering af neuroner fra humane pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...