Name: efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

XHP har vært støttet av National Institute of Health (NIH) stipend fra National Institute on Aging (NIHK01AG024496) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

1. Løsning og Media Forberedelse <ol><li> Gelatin belegg løsning: 0,1% (w / v) gelatin i DDH 2 O, autoklaveres og oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Matrigel belegg løsninger. Stamoppløsning: slow tine Matrigel (10 ml) ved 4 ° C over natten, tilsett 10 ml iskald DMEM eller DMEM/F12, bland godt og delmengde 1 ml / rør under sterilisert vev kultur hette, lagring ved -20 ° C. Working løsning: langsom tining 1 ml Matrigel delmengde ved 4 ° C i 1-2 timer, transfer til 14 ml kjølt DMEM eller DMEM/F12 og bland godt under sterilisert vevskultur panseret umiddelbart før belegg. </li><li> Menneskelig laminin belegg løsning: fortynnes 1 ml human laminin oppløsning (0,5 mg / ml i Tris bufret NaCl, oppbevares ved -80 ° C, langsom tining ved 4 ° C i 1-2 time) med iskald DMEM eller DMEM/F12 til 12,5 ml arbeidsløsningen (40 mikrogram / ml) under sterilisert vevskultur panseret umiddelbart før belegg. </li><li> Vekstfaktor stamløsninger (500-1000x): Løs vekstfaktor ved 10 mikrogram/ Ml i steriliseres buffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glyserol, 1XPBS) og lagre så 50-100 mL / tube alikvoter ved -80 ° C. </li><li> HESC media: DMEM/F12 eller KO-DMEM (80%), KO serum utskifting (20%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MEM unødvendige aminosyrer (MNAA, 1X), og β-Mercaptoethanol (100 mm), filtrert og oppbevar ved 4 ° C, supplert med 20 ng / ml bFGF før bruk. Eller erstatte &quot;KO serum erstatning&quot; med definerte komponenter: DMEM/F12 eller KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essensielle aminosyrer (MEAA , 1X), og β-Mercaptoethanol (100 mm), filtrert og oppbevar ved 4 ° C, supplert med bFGF (20 ng / ml), humant insulin (20 mikrogram / ml), askorbinsyre (50 mikrogram / ml), menneskelig activin A (50 ng / ml), humant albumin / Albumax (10 mg / ml) og human transferrin (8 mikrogram / ml) før bruk. </li><li> HESC hjertestans differensiering media: DMEM/F12 (90%), definert FBS (10%), og L-alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm). </li><li> Media inneholder nikotinamid (NAM): legg NAM til HESC media eller HESC hjertestans differensiering media til endelig konsentrasjon på 10 mM, filtrert, lagring ved 4 ° C og bruk innen 2 uker med forberedelse. </li></ol> 2. Plate Coating <ol><li> Coat plater med gelatin: Legg 2,5 ml / brønn av gelatin løsning til 6 godt plater og inkuberes over natten i 37 ° C fuktet inkubator. </li><li> Coat plater med laminin: chill gelatin-belagte plater og fjerne gelatin, tilsett 2,5 ml / brønn Matrigel eller menneskelig laminin belegg arbeider løsning til pre-kjølt gelatinized 6-brønn plater og inkuber ved 4 ° C over natten. </li></ol> 3. Passaging og Seeding Udifferensiert hESCs under definerte vilkår <ol><li> La hESC kolonier vokse til 5-7 dager gamle, og ta hESC kultur plate å dissekere mikroskop (pre-varm dissecting scenen til 37 ° C) under dissecting sterilisert panseret. </li><li> Velg hESC kolonier for å deles. Morfologisk, bør disse koloniene har&gt; 75% udifferensiert hESCs (smalle kompakte celler), vanligvis litt ugjennomsiktig (ikke hvit-stablet opp celler, ikke klart differensierte celler) med definerte kanten under dissecting mikroskop. Nøye skissere valgt koloniene og fjerne differensiert fibroblast lag som omgir koloni og all differensiert deler (hvis noen) av kolonien med kanten av P2 steril pipette tips eller trukket glass kapillær. </li><li> Fjern det gamle medier som inneholder flytende frittliggende differensierte celler ved å aspirere. Vask med hESC media (uten bFGF) en gang. Tilsett 3 ml / brønn frisk hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF. </li><li> Kutt udifferensiert hESC koloniene i små biter, og ta med sterile pipettespiss eller trukket glass kapillær. </li><li> Pool at medier som inneholder frittliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk tube. Vask platen en gang med 1 ml / brønn hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF og basseng sammen. </li><li> Aspirer Matrigel eller menneskelig laminin løsning fra belagt ferske plater. Delmengde 4 ml / brønn tESC medier som inneholder koloni stykker til en 6-brønn plate. Forsiktig overføre plate til inkubator uten risting og la koloni stykker frø over natten uten å forstyrre i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO 2. </li></ol> Fire. Cardiac Induksjon av hESCs under definerte Kultur System med nikotinamid <ol><li> På dag 3 etter såing, fjerner det meste av gamle medier fra hver brønn av platen og la nok media til å tillate hESC kolonier å være neddykket (aldri tillate hESCs tørke ut). Erstatt med 4 ml / brønn frisk hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF og 10 mM nikotinamid (NAM). </li><li> Bytt ut gamle medier med ferske hESC media inneholder 20 ng / ml bFGF og 10 mM NAM annenhver dag, og la hjerte-induced hESC kolonier vokse til dag 8-10. Ved å utsette til NAM, vil alle cellene i kolonien gjennomgå morfologi endringer til store differensierte celler som vil fortsette å formere seg. Koloniene vil øke i størrelse, og ved dag 8-10, end celler vil begynne å hope seg opp i enkelte områder av koloniene. </li></ol> 5. Fortsetter Cardiac Differensiering i Suspension Kultur <ol><li> Ta hESC kultur plate å dissekere mikroskop (pre-varm dissecting scenen til 37 ° C) under dissecting sterilisert panseret. Nøye skissere koloniene og fjerne fibroblast lag rundt kolonien (differensierte celler vandret ut av kolonien) med kanten av P2 steril pipette tips eller trukket glass kapillær. </li><li> Fjern det gamle medier som inneholder flytende frittliggende fibroblast celler ved å aspirere. Vask med hESC media (uten bFGF) en gang. Tilsett 3 ml / brønn frisk hESC media (uten bFGF). </li><li> Kutt hjerte-indusert hESC kolonier i små biter, og ta med sterile pipettespiss eller trukket glass kapillær. </li><li> Pool at medier som inneholder frittliggende koloni stykker sammen i en 50 ml konisk tube. Vask platen en gang med 1 ml / brønn hESC media (uten bFGF) og basseng sammen. </li><li> Delmengde 4 ml / brønn serum-free hESC medier som inneholder koloni stykker til en 6-godt ultralav festeplate og inkuberes i en 37 ° C fuktet inkubator å tillate flytende cellulære klynger (cardioblasts) til skjema for 4-5 dager. </li></ol> Seks. Slo Cardiomyocyte Phenotype Modning i Adhesive Kultur <ol><li> Pool media inneholder flytende cardioblasts sammen i en 50 ml konisk tube. Sentrifuger ved 1400 rpm i 5 min. Aspirer de gamle mediene så mye du kan og legge like mye frisk hESC hjertestans differensiering media inneholder 10 mM NAM. </li><li> Pipetter opp og ned for å blande flytende cardioblasts og delmengde 4 ml / godt til 6-brønn plater. Overfør platene til en 37 ° C fuktet inkubator å tillate cardioblasts å feste natten. </li><li> Bytt hESC hjertestans differensiering media inneholder 10 mM NAM annenhver dag. </li><li> På dag 8, erstatte med hESC hjertestans differensiering media uten NAM, og fortsette å erstatte HESC hjertestans differensiering media eveldig om dagen. Slo cardiomyocytes vil begynne å vises i ca 1-2 uker med kontinuerlig dyrking etter seponering av NAM og økning i antall med tiden, og kunne beholde sterk og rytmiske sammentrekninger i over 3 måneder. </li></ol> 7. Representant Resultater: Nikotinamid (NAM) er gjengitt tilstrekkelig til å indusere hESCs opprettholdt i de definerte kultur-systemet til overgangen fra pluripotency utelukkende til et cardiomesodermal fenotype (Fig. 2B). Ved eksponering av udifferensiert hESCs til NAM, vil alle cellene i kolonien gjennomgå morfologi endringer til store differensierte celler som ned-regulerer uttrykket av okt-4 og begynner å uttrykke hjertets spesifikke transkripsjonsfaktor (CSX) Nkx2.5 og α- actinin, konsistent med cardiomesoderm fenotype (Fig. 2B). Disse differensierte cellene vil fortsette å formere seg og koloniene øke i størrelse. Økt intensitet Nkx2.5 vilblir vanligvis observert i områder av kolonier hvor cellene begynner å hope seg opp (Fig. 2B). Etter frittliggende vil NAM-behandlet hESCs danne flytende cellulære klynger (cardioblasts) i en suspensjon kultur å fortsette kardiale differensiering prosessen. Etter tillater cardioblasts å feste og fortsetter å behandle med NAM for 1 uke, vil slå cardiomyocytes begynner å vises i ca 1-2 uker med kontinuerlig dyrking etter seponering av NAM med en drastisk økning i effektiviteten i forhold til spontane multi-avstamning differensiering av hESCs uten behandling i løpet av samme tidsperiode (Fig. 2C). Celler i det bankende cardiomyocyte klynger vil uttrykke markører karakteristisk for cardiomyocytes, inkludert Nkx2.5 og α-actinin (Fig. 2C). Sammentrekningene av juling cardiomyocytes ble bekreftet av elektriske profiler å være sterk, rytmisk, godt koordinert, og godt entrained, med regelmessige impulser minner om p-QRS-T-komplekser sett fra kroppsoverflate elektroder i klinisk elektrokardiogram (Fig. 2C, også se video). Den cardiomyocytes kunne beholde sin sterke kontraktilitet i over 3 måneder. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Figur 1. Generelle ordninger for konvensjonelle tilnærming versus små-molekyl-induksjon tilnærming for differensiering av menneskelige pluripotent stamceller mot spesialiserte funksjonelle celler. (A) En skjematisk av konvensjonell tilnærming ved hjelp av multi-avstamning tilbøyelighet av menneskelige pluripotent stamceller gjennom spontan germ lag differensiering. (B) En skjematisk godt kontrollerte effektiv induksjon av menneskelige pluripotent stamceller eksklusivt til en bestemt klinisk relevant avstamning med enkle bestemmelse av små molekyler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Figur 2. Nikotinamid induserer hjertestans avstamning spesifikasjon direkte av pluripotency under definerte forhold og progresjon mot juling cardiomyocytes. (A) Skjematisk skildrer av protokollen tid linje rettet kardiale differensiering av hESCs. (B) Ved eksponering av udifferensiert hESCs til nikotinamid (NAM) under definerte kulturen, stort differensiert Oct-4 (rød) negative cellene i kolonien begynte å dukke opp, sammenlignet med mock-behandlet (DMSO) hESCs som kontrollen. NAM-indusert Oct-4-negative cellene begynte å uttrykke Nkx2.5 (grønn) og α-actinin (rød), i samsvar med tidlig hjerte differensiering. Gradvis økt intensitet av Nkx2.5 ble vanligvis observert i områder av kolonien der cellene begynte å hope seg opp. Alle celler er angitt med DAPI farging av atomkjerner deres (blå). (C) NAM-indusert hjertestans-begått hESCs ga slo cardiomyocytes med en drastisk økning i effektiviteten, som vurderes av den cellulære clusregistre som viste rytmiske sammentrekninger (se elektrofysiologisk profil og videoer), og immunopositive for Nkx2.5 (grønn) og α-actinin (rød). Fase bilder av representative store juling cardiomyocyte klynger og høyere makt bilder av representative kontrahering hjertestans musklene er vist (se også tilsvarende videoer). Pilene indikerer store juling cardiomyocyte klynge brukt til elektrofysiologiske opptak. Elektrofysiologiske profil juling cardiomyocytes viser regelmessige, entrained, rytmiske impulser minner om p-QRS-T-komplekser sett i kliniske elektrokardiogram. Scale barer: 0,1 mm. Video: kontraherende cardiomyocytes differensiert fra NAM-indusert hESCs. Videoer 1 og 2 viser representative store juling cardiomyocyte klynger i ca 1 og 3 mnd etter utlegg. Video 3 og 4 viser representative kontrahering hjertestans muskler ved høyere makt. Video 5 viser en typical små juling cardiomyocyte cluster spontant differensiert fra hESCs uten NAM behandling som kontroll. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Klikk her for å se video 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Klikk her for å se Video 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Klikk her for å se Video 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Klikk her for å se Video 4.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Klikk her for å se Video 5.</a>

<ol>
	<li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering:+a+review.">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li><li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li><li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair.">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li><li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li><li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+transcription+factor+Csx/Nkx2-5:+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases.">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li><li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li><li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy.">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Forfatterne erklærer konkurrerende interesser. XHP er grunnleggeren av Xcelthera. XHP og eys har intellektuelle egenskaper relatert til hESCs.

En av de store utfordringene for både utviklings-studier og klinisk oversettelsen har vært hvordan å kanalisere den brede differensiering potensial pluripotent menneskelige stamceller til en ønsket fenotype effektivt og forutsigbart. Selv om slike celler kan differensiere spontant in vitro inn i cellene til alle bakterie lagene ved å gå gjennom en multi-avstamning samlet scenen, i hESC-avledet multi-avstamning aggregater (embryoid organer), bare en svært liten brøkdel av celler (&lt;2%) spontant differensieres til cardiomyocytes 13-15 (Fig. 1A). Etter immunoselection ble beriket bestandene av cardiomyocytes kunne fungere som biologisk pacemakere å redde funksjonen til en skadet myokard mekanisk og elektronisk etter injeksjon inn i hjertet av dyremodeller 13. I gnager infarcted modeller, ble innpodet hESC-avledet hjertestans progenies stand til å overleve og modne opptil 12 uker, og delvis remuscularize den skadde hjertet og forbedre kontraktile funksjon 14,15. Har imidlertid ineffektivitet i generering menneskelige hjerte-begått cellene gjennom multi-avstamning differensiering av pluripotent celler og den høye risikoen for tumorigenicity følgende transplantasjon hindret ytterligere kliniske oversettelse. Utvikle strategier for å kanalisere den brede differensiering potensial pluripotent hESCs eksklusivt og forutsigbart i en hjertestans fenotype er avgjørende for å utnytte kraften av hESC biologi i hjertet feltet. For å oppnå jevnt konvertering av menneskelige pluripotent stamceller til en bestemt avstamning, benyttet vi en definert kultur system i stand til å opprettholde spredning av udifferensiert hESCs å identifisere betingelsene for godt kontrollerte effektiv induksjon av pluripotent hESCs utelukkende til en bestemt klinisk relevant avstamning ved enkle bestemmelse av små molekyler (fig 1B). Vi fant at nikotinamid indusert hjertestans-ætten engasjement direkte fra pluripotent hESCs under definerte kultur som videre utviklet seg til å slå cardiomyocytes med høy effektivitet (fig 2). Nkx2.5 er en evolutionally bevares homeobox transkripsjonsfaktor uunnværlig for normal hjertefunksjon utvikling og mutasjoner av genet er assosiert med humant medfødt hjertesykdom (CHD), den vanligste menneskelige fødsel defekt 16. Expression of Nkx2.5 er tidligst markør for hjerte forløper celler i alle virveldyr så langt undersøkt og er avgjørende for riktig hjerte septation og dannelse / modning av elektriske ledningssystem 16. I virveldyr, utbruddet og mønster av tidlig Nkx2.5 uttrykk omtrent sammenfallende med timing og areal av kardiale spesifikasjonen tidlig embryogenese, og Nkx2.5 genet fortsetter å komme til uttrykk gjennom utviklingen i hjertet 16. I vår hESC modell, dukket NAM å utløse hjertestans induksjon direkte fra pluripotent hESCs ved å fremme uttrykket av hjerte-spesifikke transcription faktor Nkx2.5 i en prosess som kan emulere angivelse av cardiomesoderm fra pluripotent epiblast i humane embryonale cardiogenesis. Fremtidige studier vil avdekke genetiske og epigenetic kontroll molekyler i menneskets hjerte utvikling som alternativer, som kan bane vei for lite molekyl-mediert direkte kontroll og modulering av hESC pluripotent skjebne når utlede klinisk relevante linjene for regenerativ behandling. Uten NAM behandling, vil &lt;2% hESCs gjennomgår spontan differensiering inn juling cardiomyocytes 12-15. Med NAM behandling, har vi vært i stand til å generere&gt; 95% embryonale hjertestans prekursorer og&gt; 50% juling cardiomyocytes fra hESCs opprettholdes under en definerer kultur på en prosess som kan etterligne humane embryonale hjerte utvikling 12. Nylig har kjent hjerte-skjebnen bestemme gener blitt brukt til å transdifferentiate musen fibroblaster i post-natal slo cardiomyocytes med lav virkningsgrad på &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Imidlertid har reprogrammeres somatiske celler historisk sett vært forbundet med unormal genekspresjon og akselerert senescence med nedsatt terapeutisk nytte 19-21. Endelig er protokollen vi har etablert her begrenset til pluripotent hESCs avledet fra den indre cellemasse (ICM) eller epiblast av den menneskelige blastocyst 4,5, kanskje ikke gjelde for andre pluripotent celler, inkludert dyre-stammer ESCs, ESCs avledet fra tidligere morula (åtte-cellers)-trinns embryo 22, og kunstig omprogrammeres celler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Navn på reagens </th><th> Firma </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (valgfritt) </th></tr><tr><td> Gelatin </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD biovitenskap </td><td> 356231 </td><td> Vekstfaktor redusert </td></tr><tr><td> Menneskelig laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum erstatning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM uviktig aminosyre løsning (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminosyrer løsning (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsyre </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Definert FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-godt ultralav festeplate </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-bra plate </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Hittil har mangelen på et egnet human kardial celle kilden vært stort tilbakeslag i regenerere den menneskelige myokard, enten ved celle-baserte transplantasjon eller ved hjertestans tissue engineering 1-3. Cardiomyocytes bli terminalt differensiert snart etter fødselen, og mister evnen til å spre seg. Det er ingen bevis for at stamceller / stamceller hentet fra andre kilder, for eksempel benmargen eller ledningen blod, er i stand til å gi opphav til kontraktile hjertemuskelen cellene etter transplantasjon til hjertet 1-3. Behovet for å fornye eller reparere den skadde hjertemuskelen har ikke blitt møtt med voksen stilk cellen terapi, enten endogene eller via celle levering 1-3. Den genetisk stabile menneskelige embryonale stamceller (hESCs) har ubegrenset utvidelse evne og ubegrenset plastisitet, proffering en pluripotent reservoar for in vitro avledning av store forsyninger av menneskelig somatiske celler som er begrenset til linjen i nødav reparasjon og regenerering 4,5. På grunn av forekomsten av hjerte-og karsykdommer over hele verden og akutt mangel på donor organer, er det stor interesse i å utvikle hESC-baserte terapier som et alternativ tilnærming. Har imidlertid hvordan å kanalisere den brede differensiering potensial pluripotent hESCs effektivt og forutsigbart til en ønsket fenotype vært en stor utfordring for både utviklings-studier og klinisk oversettelse. Konvensjonelle tilnærminger stole på multi-avstamning helning pluripotent celler gjennom spontan germ lag differensiering, noe som resulterer i ineffektive og ukontrollerbar avstamning-engasjement som ofte følges av fenotypiske heterogenitet og ustabilitet, dermed høy risiko for tumorigenicity 6-8 (se en skjematisk i fig. 1A). I tillegg kan udefinert utenlandske / dyr biologisk kosttilskudd og / eller feeders som har typisk vært brukt til isolasjon, ekspansjon, og differensiering av hESCs gjør direkte bruk av slike celle-specialized grafts hos pasienter problematisk 9-11. For å overvinne disse hindringene, har vi løst elementene i en definert kultur system nødvendig og tilstrekkelig for å opprettholde epiblast pluripotence av hESCs, tjene som en plattform for de novo avledning av klinisk egnet hESCs og effektivt lede slike hESCs jevnt mot klinisk relevant linjene av små molekyler 12 (se en skjematisk i fig. 1B). Etter screening en rekke små molekyler og vekstfaktorer, fant vi at slike definerte vilkår gjengitt nikotinamid (NAM) tilstrekkelig til å indusere angivelse av cardiomesoderm direkte fra pluripotent hESCs at videre kommet til cardioblasts som genererte menneskelige slå cardiomyocytes med høy effektivitet (Fig. 2 ). Vi definerte vilkår for induksjon av cardioblasts direkte fra pluripotent hESCs uten en mellomliggende multi-avstamning embryoid kroppen stadium, slik at godt kontrollerte effektiv avledning av etstor tilførsel av menneskelige hjerte celler over hele spekteret av utviklingsstadier for celle-basert terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Vi har etablert en protokoll for induksjon av cardioblasts direkte fra pluripotent humane embryonale stamceller vedlikeholdt under definerte forhold med små molekyler, som muliggjør avledning av en stor tilførsel av menneskelig hjerte stamfedre og funksjonelle cardiomyocytes for hjerte-reparasjon.

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Utarbeidelse av mus embryonale fibroblast celler Egnet for dyrking humane embryonale og Induced pluripotent stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Rask og effektiv produksjon av nerveceller fra menneskelige pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...